HEPENGBIO细胞蛋白磷酸化酶2A活性比色法定量检测试剂盒产品说明书

主要用途

HEPENGBIO细胞蛋白磷酸化酶2A（PP2A）活性比色法定量检测试剂是一种旨在使用特异性合成底物磷酸化多肽，在PP2A去磷酸化后，释放出游离磷酸根，由硫酸亚铁氨还原产生钼蓝显色反应后峰值的变化，采用比色法测定其峰值的变化，以此进行测算单位酶活性的方法。其适合于各种细胞裂解悬液样品包括免疫沉淀复合物和粗提或部分纯化酶样品的蛋白磷酸化酶2A活性及其抑制剂的检测。广泛应用于细胞凋亡、蛋白组学、病理生理学、神经病变等研究。产品不含污染性蛋白酶，严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定，反应优化，检测敏感。

技术背景

蛋白磷酸化酶2A（protein phosphatase 2A；PP2A；EC 3.1.3.16），又称为2型蛋白丝/苏氨酸磷酸化酶，催化亚体，α异构体（type II protein serine/threonine phosphatasecatalytic subunit，alpha isoform），是主要的丝/苏氨酸磷酸化酶成员之一，从酵母到人类高度进化保留。其功能与细胞周期进程、DNA复制和转录、RNA剪切、转译等有关。PP2A的结构为异源三体，包括结构亚体、调节/目标亚体和催化亚体。PP2A的目标蛋白是肿瘤信号通路的蛋白分子，例如Raf，MEK，Akt等。基于特异性底物磷酸化多肽RKpTIRR，在抑制剂黑海绵酸（okadaic acid）存在与否的情况下，受到蛋白磷酸化酶2A的去磷酸化作用，释放出游离磷酸根，由硫酸亚铁氨还原产生钼蓝显色反应后，在分光光度仪下（660nm波长）产生峰值的变化，由此测定黑海绵酸敏感性蛋白磷酸化酶2A（PP2A）的特异活性。

产品内容

HEPENGBIO清理液（Reagent A）120毫升

HEPENGBIO裂解液（Reagent B）10毫升

HEPENGBIO缓冲液（ReagentC）5毫升

HEPENGBIO阴性液（ReagentD） 3毫升

HEPENGBIO反应液（ReagentE）400微升

HEPENGBIO显色液（ReagentF）10毫升

HEPENGBIO标准液（ReagentG）600微升

HEPENGBIO专性液（Reagent H）100微升

产品说明书 1份

保存方式

保存HEPENGBIO裂解液（Reagent B）、HEPENGBIO反应液（ReagentE）、HEPENGBIO显色液（ReagentF）和HEPENGBIO专性液（Reagent H）在－20℃冰箱里，避免反复冻融；HEPENGBIO缓冲液（ReagentC）在室温下；其余的保存在4℃冰箱里；HEPENGBIO显色液（ReagentF）具有腐蚀性，避免直接用手接触；6月

用户自备

15毫升离心管：用于样品处理的容器

1.5毫升离心管：用于样品处理和保存的容器

细胞刮脱棒：用于贴壁细胞脱离

（微型）台式离心机：用于样品收集

培养箱：用于孵育反应物

500微升1厘米光径比色皿：用于比色的容器

分光光度仪：用于比色分析

实验步骤

实验开始前，将－20℃冰箱里的试剂盒中的试剂溶液放进冰槽里融化。然后进行下列操作。

一、 样品准备

1． 准备好75cm²细胞培养瓶或100mm细胞培养皿的待测培养细胞（5 X 10⁷细胞）

2． 小心加入3毫升预冷的HEPENGBIO清理液（Reagent A），覆盖生长表面

3． 小心抽去清理液

4． 使用细胞刮脱棒轻柔刮脱细胞

5． 加入3毫升HEPENGBIO清理液（Reagent A），混匀细胞

6． 移入到预冷的15毫升锥形离心管（注意：悬浮细胞从这一步骤开始）

7． 放进4℃台式离心机离心5分钟，速度为300g

8． 小心抽去上清液

9． 加入500微升HEPENGBIO裂解液（Reagent B），充分混匀

10． 转移到预冷的1.5毫升离心管

11． 强力涡旋震荡15秒

12． 置于冰槽里孵育30分钟

13． 放进4℃微型台式离心机离心5分钟，速度为16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）

14． 小心移取500微升上清液到新的预冷的1.5毫升离心管

15． 移取2微升进行蛋白定量测定（注意：建议使用HEPENGBIO Bradford蛋白质浓度定量试剂盒）

16． 即刻放进－70℃保存或置于冰槽里继续后续操作

二、测定准备

1． 准备好待测样品（例如细胞裂解萃取液等），置于冰槽里（注意：样品须澄清）

2． 设定好分光光度仪（温度为37℃）：波长为660nm，并置零

3． 准备好5个1.5毫升离心管，标记为1至5号管

4． 按下表分别加入HEPENGBIO阴性液（ReagentD）和HEPENGBIO标准液（ReagentG）到每个离心管，混匀

5． 将1至5号管放进冰槽里备用，避免光照；标准管浓度见下表

三、 标准曲线测定

1． 移取200微升上述配制的标准液到新的比色皿

2． 在30℃温度下孵育20分钟

3． 加入200微升HEPENGBIO显色液（ReagentF），混匀

4． 在37℃温度下孵育10分钟，避免光照

5． 即刻放进分光光度仪检测：获得吸光读数

6． 重复实验步骤1至6四次

7． 构建标准曲线：纵座标（Y轴）为吸光单位（A）；横座标（X轴）为标准磷浓度（微摩尔/升）

四、 （选择步骤）样品背景测定

1． 移取120微升HEPENGBIO缓冲液（ReagentC）到新的比色皿

2． 加入20微升待测样品（总量50微克细胞裂解萃取液蛋白）

3． 在30℃温度下孵育20分钟

4． 加入60微升HEPENGBIO阴性液（ReagentD），混匀

5． 加入200微升HEPENGBIO显色液（ReagentF），混匀

6． 在37℃温度下孵育10分钟，避免光照

7． 即刻放进分光光度仪检测：获得吸光读数

8． 根据标准曲线获得样品背景对应磷浓度（微摩尔/升）

五、 样品总活性测定

1． 移取100微升HEPENGBIO缓冲液（ReagentC）到新的比色皿

2． 加入20微升待测样品（总量50微克细胞裂解萃取液蛋白）

3． 在30℃温度下孵育2分钟

4． 加入20微升HEPENGBIO反应液（ReagentE）

5． 在30℃温度下孵育20分钟

6． 加入60微升HEPENGBIO阴性液（ReagentD），混匀

7． 加入200微升HEPENGBIO显色液（ReagentF），混匀

8． 在37℃温度下孵育10分钟，避免光照

9． 即刻放进分光光度仪检测：获得吸光读数

10． 根据标准曲线获得样品总活性对应磷浓度（微摩尔/升）

六、 样品非特异性活性测定

1． 移取90微升HEPENGBIO缓冲液（ReagentC）到新的比色皿

2． 加入10微升HEPENGBIO专性液（Reagent H）

3． 加入20微升待测样品（总量50微克细胞裂解萃取液蛋白）

4． 在30℃温度下孵育5分钟

5． 加入20微升HEPENGBIO反应液（ReagentE）

6． 在30℃温度下孵育20分钟

7． 加入60微升HEPENGBIO阴性液（ReagentD），混匀

8． 加入200微升HEPENGBIO显色液（ReagentF），混匀

9． 在37℃温度下孵育10分钟，避免光照

10． 即刻放进分光光度仪检测：获得吸光读数

11． 根据标准曲线获得样品非特异活性对应磷浓度（微摩尔/升）

七、 计算样品活性

（1） 样品总活性和非特异活性

{[根据标准曲线获得样品总活性或非特异活性对应磷浓度（微摩尔/升）—根据标准曲线获得样品背景对应磷浓度（微摩尔/升）]X10（体系倍数）X样品稀释倍数}÷20（反应时间；分钟）＝纳摩尔磷/分钟/毫升

转换：纳摩尔磷/分钟/毫升÷（样品蛋白浓度）毫克/毫升＝纳摩尔磷/分钟/毫克

（2） 样品特异活性计算

样品特异活性＝样品总活性－样品非特异活性

八、酶标仪测定

1． 在96孔板上做好相应标记：标准样品、样品总活性、样品非特异活性

2． 分别移取100微升上述配制的标准液到相应的标准样品孔里

3． 移取50微升HEPENGBIO缓冲液（ReagentC）到样品总活性孔里

4． 移取45微升HEPENGBIO缓冲液（ReagentC）到样品非特异活性孔里

5． 移取5微升HEPENGBIO专性液（Reagent H）到样品非特异活性孔里

6． 分别移取10微升待测样品（总量50微克细胞裂解萃取液蛋白）到样品总活性和样品非特异活性孔里

7． 分别移取10微升HEPENGBIO反应液（ReagentE）到样品总活性和样品非特异活性孔里

8． 在30℃温度下，置于平式摇荡仪孵育10分钟，速度为50RPM

9． 分别移取30微升HEPENGBIO阴性液（ReagentD）到样品总活性和样品非特异活性孔里

10． 分别移取100微升HEPENGBIO显色液（ReagentF）到所有孔里

11． 在37℃温度下，置于平式摇荡仪孵育10分钟，速度为50RPM，避免光照

12． 即刻放进酶标仪检测：获得吸光读数

13． 构建标准曲线：纵座标（Y轴）为吸光单位（A）；横座标（X轴）为标准磷浓度（微摩尔/升）

14． 根据标准曲线获得样品对应磷浓度（微摩尔/升）

15． 计算样品活性

（1） 样品总活性和非特异活性

{[根据标准曲线获得样品总活性或非特异活性对应磷浓度（微摩尔/升）]X10（体系倍数）X样品稀释倍数}÷20（反应时间；分钟）＝纳摩尔磷/分钟/毫升

转换：纳摩尔磷/分钟/毫升÷（样品蛋白浓度）毫克/毫升＝纳摩尔磷/分钟/毫克

（2） 样品特异活性计算

样品特异活性＝样品总活性－样品非特异活性

注意事项

1． 本产品为25次（10个样本）操作，包括5次（点）标准测定

2． 操作时，须戴手套

3． 系统操作过程中，标准曲线测定只需1条

4． 样品背景读数大于1.0，建议稀释样品至0.5-1.0之间

5． 如果加样准，样品背景读数可以跳过

6． HEPENGBIO显色液（ReagentF）具有腐蚀性，避免直接用手接触

7． 样品切忌使用磷酸缓冲液、EDTA、EGTA和脱氧胆酸纳处理

8． 如果使用免疫沉淀复合物作为待测样品，建议使用HEPENGBIO通用型蛋白免疫共沉淀（蛋白A树脂）试剂盒

9． 比色测定后，比色皿须清洗底

10． 建议使用比色皿测定

11． 如果使用96孔板测定，建议反应孵育时，置于平式摇荡仪摇荡孵育，速度为50RPM

12． 如果用户没有660nm波长，可以使用600至660nm的任一波长替代

13． 吸光读数增高，表明具有酶活性

14． 建议待测样本蛋白浓度为50微克/20微升；如果样本酶活性过低或过高，则可以增加或降低样本量； （本公司提供HEPENGBIOBradford蛋白质浓度定量试剂盒）

15． 蛋白磷酸化酶2A活性单位浓度定义：在30℃温度下，pH 8.0的情况下，每单位酶在单位时间内（每分钟）释放1微摩尔的磷

16． 本公司提供系列蛋白磷酸酶检测试剂产品

本产品仅供科研使用,请勿用于医药、临床治疗、食品及化妆品等用途。