HEPENGBIO细胞磷脂酶D（Phospholipase D）总水解活性酶连续循环荧光定量

检测试剂盒产品说明书

主要用途

HEPENGBIO细胞磷脂酶D（Phospholipase D）总水解活性酶连续循环荧光定量检测试剂是一种旨在通过磷脂酶D、胆碱氧化酶、过氧化酶反应系统中生成的过氧化氢，与非荧光性染料乙酰二氢氧吩恶嗪反应产生高度荧光的羟基异吩恶唑酮后荧光峰值的变化，来测定细胞裂解样品中酶活性的方法。其适用于各种动物或人体细胞裂解萃取样品或质膜分离样品磷脂酶D的总水解活性检测。产品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定。

技术背景

磷脂酶（phospholipase），是一种脂质水解酶，催化磷脂的水解，产生脂肪酸和其它亲脂产物，参与磷脂代谢。磷脂酶家属有四种类型亚酶，包括A、B、C和D。磷脂酶A（phospholipase A；PLA）主要水解磷脂sn-1（磷脂酶A1催化）和sn-2（磷脂酶A2催化）位置上的乙酰基；磷脂酶B（phospholipase B；PLB）同时水解磷脂的sn-1和sn-2位置上的乙酰基，又称为溶血磷脂酶（lysophospholipase）；磷脂酶C（phospholipaseC；PLC）在磷酸基前水解，释放二酰基甘油（diacylglycerol；DAG）和第二信使分子三磷酸肌醇（inositol triphosphate）；磷脂酶D（phospholipaseD；PLD；EC3.1.4.4）在磷酸基后水解，释放磷脂酸（phosphatidic acid）。哺乳动物磷脂酶D，又称为磷脂酰胆碱磷脂酸水解酶（Phosphatidylcholine phosphatidohydrolase），有2个异构体：磷脂酶D1和D2，存在于细胞质膜上，通过催化特异性磷脂酰胆碱（phosphatidylcholine；PC）上磷酸二酯键（phosphodiester）的水解，产生磷脂酸和胆碱（choline），磷脂酸作为信号分子，进一步水解为二酰基甘油，与跨膜信号功能、囊泡运输（vesicle trafficking）、细胞骨架调节等有关。同时通过转移磷脂基团到原生醇类的羟基上的磷脂转移活性（transphosphatidylation），帮助合成磷脂酰乙醇胺（phosphatidyl ethanolamine；PE）、磷脂酰丝氨酸（phosphatidylserine；PS）和磷脂酰甘油（phosphatidylglycerol；PG）等可溶性脂类产物。基于底物磷脂酰胆碱，在磷脂酶D的作用下，水解产生为磷脂酸和胆碱后，通过胆碱氧化酶（choline oxidase）生成过氧化氢，然后借助过氧化酶（peroxidase）的作用，与非荧光性染料乙酰二氢氧吩恶嗪（10-acetyl-3,7-dihydroxyphenoxazine；ADHP）反应，生成高度荧光的羟基异吩恶唑酮（resorufin）后荧光峰值的变化（激发波长530nm，散发波长590nm），来定量分析磷脂酶D的总水解活性。磷脂酶D连续循环反应系统为：

PLD

phosphatidylcholine+H2O→phosphatidic acid +choline

choline oxidase

choline + O2 + H2O→Betaine aldehyde +H2O2

peroxidase

H2O2 +ADHP→ Resorufin+H2O

产品内容

HEPENGBIO清理液（Reagent A）120毫升

HEPENGBIO裂解液（Reagent B）20毫升

HEPENGBIO缓冲液（Reagent C）5毫升

HEPENGBIO反应液（Reagent D）400微升

HEPENGBIO酶促液（Reagent E）500微升

HEPENGBIO底色液（Reagent F）125微升

HEPENGBIO标准液（Reagent G）50微升

产品说明书1份

保存方式

保存HEPENGBIO清理液（Reagent A）在4℃，其余的保存在－20℃冰箱里；HEPENGBIO底色液（Reagent F）避免光照；有效保证6月

用户自备

1.5毫升离心管：用于样品保存和反应操作的容器

15毫升锥形离心管：用于样品制备的容器

细胞刮脱棒：用于细胞脱离

（微型）台式离心机：用于样品操作

比色皿或黑色96孔板：用于荧光分析的容器

荧光分光光度仪或荧光酶标仪：用于荧光分析

实验步骤

一、 样品准备

1． 准备好75cm²细胞培养瓶或100mm细胞培养皿的待测培养细胞（1至5 X 10⁷细胞）

2． 小心加入3毫升HEPENGBIO清理液（Reagent A），覆盖生长表面

3． 小心抽去清理液

4． 使用细胞刮脱棒轻柔刮脱细胞（注意：可以使用胰酶消化）

5． 加入3毫升HEPENGBIO清理液（Reagent A），混匀细胞

6． 移入到预冷的15毫升锥形离心管（注意：悬浮细胞从这一步骤开始）

7． 放进4℃台式离心机离心5分钟，速度为300g

8． 小心抽去上清液

9． 加入500微升HEPENGBIO裂解液（Reagent B），充分混匀

10． 转移到预冷的1.5毫升离心管

11． 强力涡旋震荡30秒，充分混匀

12． 置于冰槽里孵育30分钟，期间每10分钟强力涡旋震荡30秒（注意：如需暂时停止，放进－70℃冰箱里储存备用）

13． 放进4℃微型台式离心机离心5分钟，速度为1000g

14． 小心移取500微升上清液到新的预冷的1.5毫升离心管

15． （选择步骤）放进4℃超速离心机离心60分钟，速度为105000g

16． （选择步骤）小心抽去上清液

17． （选择步骤）加入500微升HEPENGBIO裂解液（Reagent B），混匀颗粒群

18． 移取10微升进行蛋白定量检测（注意：建议使用HEPENGBIO BCA蛋白质浓度定量试剂盒）

19． 即刻放进－70℃保存或置于冰槽里继续后续操作

二、 测定准备

1． 准备好上述待测样品，置于冰槽里

2． 设定好荧光分光光度仪或荧光酶标仪：激发波长530nm，散发波长590nm，并置零

3． 准备好5个1.5毫升离心管，标记为1至5号管

4． 加入80微升HEPENGBIO缓冲液（ReagentC）到1号管

5． 分别加入50微升HEPENGBIO缓冲液（ReagentC）到2至5号管

6． 移取20微升HEPENGBIO标准液（ReagentG）到1号管，混匀

7． 小心移取50微升1号管稀释的HEPENGBIO标准液（ReagentG）到2号管，混匀

8． 小心移取50微升2号管稀释的HEPENGBIO标准液（ReagentG）到3号管，混匀

9． 小心移取50微升3号管稀释的HEPENGBIO标准液（ReagentG）到4号管，混匀

10． 将1至5号管放进冰槽里备用，避免光照；标准管浓度见下表

11． 从－20℃冰箱里取出试剂，置于冰槽里融化；HEPENGBIO底色液（ReagentF）避免光照

12． HEPENGBIO缓冲液（ReagentC）室温下均衡温度

三、 标准曲线测定

1． 移取150微升HEPENGBIO缓冲液（ReagentC）到新的1.5毫升离心管

2． 加入15微升HEPENGBIO反应液（ReagentD）

3． 加入10微升上述配制的HEPENGBIO标准液（ReagentG）

4． 涡旋震荡5秒

5． 在30℃温度下孵育20分钟

6． 转移到100微升比色皿或黑色96孔板

7． 加入20微升HEPENGBIO酶促液（ReagentE）

8． 加入5微升HEPENGBIO底色液（ReagentF）

9． 在37℃温度下孵育30分钟

10． 即刻放进荧光分光光度仪或荧光酶标仪检测：获得相对荧光读数

11． 重复实验步骤1至10四次

12． 构建标准曲线：纵座标（Y轴）为相对荧光单位；横座标（X轴）为标准胆碱浓度（微摩尔/升）

四、 样品测定

1． 移取150微升HEPENGBIO缓冲液（ReagentC）到新的1.5毫升离心管

2． 加入15微升HEPENGBIO反应液（ReagentD）

3． 加入10微升待测样品（100微克蛋白）（注意：样品须清澈）

4． 涡旋震荡5秒

5． 在30℃温度下孵育20分钟

6． 转移到100微升比色皿或黑色96孔板

7． 加入20微升HEPENGBIO酶促液（ReagentE）

8． 加入5微升HEPENGBIO底色液（ReagentF）

9． 在37℃温度下孵育30分钟

10． 即刻放进荧光分光光度仪或荧光酶标仪检测：获得相对荧光读数

11． 根据标准曲线获得样品对应胆碱浓度（微摩尔/升）

五、 计算样品活性

[根据标准曲线获得样品对应胆碱浓度（微摩尔/升）X样品稀释倍数] ÷20（反应时间；分钟）＝纳摩尔/毫升/分钟÷（样品蛋白浓度）毫克/毫升＝纳摩尔/毫克/分钟

注意事项

1． 本产品为20次操作

2． 操作时，须戴手套

3． 系统操作过程中，标准测定只需1次

4． 样品须澄清，至关重要

5． 避免使用DTT、巯基乙醇、、EDTA、SDS等，否则干扰检测

6． 建议使用荧光酶标仪检测

7． 测定值由低到高变化

8． 荧光测定后，比色皿须清洗

9． 样本测定20分钟读数高于0分钟读数表明具有酶活性

10． 建议待测样本蛋白浓度为100微克/10微升；如果样本酶活性过低或过高， 则可以增加或降低样本量（本公司提供HEPENGBIOBCA蛋白质浓度定量试剂盒）

11． 如果待测样品浓度过高或过低，可以调整样品浓度

12． 磷脂酶D单位活性定义为：在30℃，pH8.0条件下，每分钟内能够水解1微摩尔磷脂酰胆碱所需的酶量作为一个活性单位

13． 本公司提供系列磷脂酶检测试剂产品

质量标准

1． 本产品经鉴定性能稳定

2． 本产品经鉴定检测敏感

本产品仅供科研使用,请勿用于医药、临床治疗、食品及化妆品等用途