冰冻切片组织线粒体膜通道孔（MPTP）荧光检测试剂是一种旨在通过钙黄绿素-钴技术，选择性地聚集在线粒体内呈现荧光染色，而存在于或由线粒体释放到细胞浆的荧光染料，即刻发生荧光淬灭，来分析和观察线粒体膜通道孔活性的权威而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适用于各种冰冻组织线粒体（动物、人体、昆虫等）膜通道孔活性的检测。产品严格无菌，即到即用，分辨率高，操作简捷，性能稳定。

技术背景

线粒体膜通道孔（mitochondrial permeability transition pore；MPTP）是由线粒体内外膜成分构成的非特异性且钙离子依赖性通道。在细胞凋亡或坏死时，线粒体内容物通过膜通道孔释放到胞浆中。膜通道孔的开放，显著改变线粒体的通透性。钙离子过度进入、线粒体谷胱苷肽的氧化和活性氧族水平的增加等导致膜通道孔的持续开放，而造成细胞色素C的释放和线粒体膜电位的消失。钙黄绿素-AM，又称双甲亚胺二乙酸钠荧光素-乙酰氧基甲基酯【bis（bis-carboxymethyl amino methyl fluorescein）-acetoxymethyl ester】，作为荧光探针：第一，适宜的分子量622d，小于1.5kd；第二，几乎不具有膜结合性；第三，不是线粒体酶的底物；第四，容易进入细胞及其线粒体。钙黄绿素-AM进入细胞后，被细胞内酯酶切离，产生具有极性的荧光性强的钙黄绿素。钙黄绿素进入线粒体后，被线粒体俘获。同时胞浆内的钙黄绿素受到其淬灭剂钴离子的淬灭。一旦线粒体膜通道孔瞬时开放，钙黄绿素释放出来，被钴离子淬灭。线粒体内钙黄绿素荧光的变化，表明膜通道孔的开放状态。

产品内容

清理液（Reagent A） 毫升

染色液（Reagent B） 微升

中和液（Reagent C） 毫升

产品说明书 1份

保存方式

保存染色液（Reagent B）在－20℃冰箱里，避免光照；其余的保存在4℃冰箱里；有效保证6月

用户自备

1.5毫升离心管：用于染色工作液配制和组织细胞染色的容器

培养箱：用于染色孵育

（共聚焦）荧光显微镜：用于组织细胞荧光分析

实验步骤

实验开始前，将－20℃冰箱里的试剂盒中的染色液（Reagent B）置入冰槽里融化，中和液（Reagent C）放进37℃恒温水槽里预热。然后移出xx微升染色液（Reagent B）到新的1.5毫升离心管，加入xx微升中和液（Reagent C），混匀后，标记为染色工作液，置入暗室里。然后进行下列操作。

1． 准备5片待测的厚为10微米的未经固着处理的冰冻切片

2． 置于室温下，小心加上xx微升预冷的清理液（Reagent A），铺满整个切片表面

3． 小心移去切片上的清理液（Reagent A）

4． 小心加上xx微升室温预热的染色工作液，铺满整个切片表面

5． 在37℃湿润培养箱里，孵育30至60分钟（注意：避免液体蒸发）

6． 小心移去切片上的染色工作液，避免光照

7． 小心加上xx微升清理液（Reagent A），铺满整个切片表面

8． 小心移去切片上的清理液（Reagent A）

9． 重复实验步骤7和8一次

10． 放上盖玻片或封片

11． 即刻在（共聚焦）荧光显微镜下观察（定性检测）：激发波长488nm，散发波长505nm――绿色荧光减弱，表明膜通道孔活性（MPTP）增强

注意事项

1． 本产品为50次操作

2． 操作时，避免污染母液

3． 操作时，须戴手套

4． 建议使用新鲜组织（手术切除后1小时内）制成的冰冻切片

5． 染色前，所有试剂溶液，除染色液（Reagent B）外，需37℃预热

6． 建议组织染色完成后，即刻进行荧光检测分析

7． 孵育时，必须避免光照

8． 本产品友好使用于双重染色或重叠染色

9． 如果不具备505nm散发波长的滤波器，可以使用505nm至530nm中的任一波长

10． 本公司提供膜通道孔抑制剂： 0.2毫摩尔环胞素A（cyclosporine A）－12226，维护荧光完整

11． 本公司提供系列线粒体分析试剂产品

质量标准

1． 本产品经鉴定性能稳定

2． 本产品经鉴定荧光清晰