标记法载玻片细胞繁殖荧光显微镜检测试剂是一种旨在使用溴脱氧尿嘧啶核苷（BrdU）替代脱氧胸腺嘧啶核苷（Thymidine）整合到合成的DNA链中，再运用抗BrdU单克隆抗体以及荧光染料缀合物二抗，通过荧光显微镜评价DNA合成和细胞繁殖水平的权威而经典的技术方法。该技术由大师级科学家精心研制、成功实验证明的。主要适用于各种活体细胞（动物、人体、植物等）的DNA合成分析。广泛用于细胞繁殖，包括细胞衰老、细胞凋亡的研究。产品严格无菌，即到即用，反应敏感，操作简捷，性能稳定，荧光清晰。

技术背景

溴脱氧尿嘧啶核苷（5－bromo－2－deoxyuridine；BrdU）是DNA前体胸腺嘧啶核苷类似物，通过竞争掺入DNA合成期（S期）细胞单链DNA核苷酸序列替代胸腺嘧啶。由于组织细胞内无内源性BrdU存在，应用BrdU与胸腺嘧啶竞争掺入的强度，来分析细胞增殖状况，包括增殖细胞的种类，增殖速度等细胞动力学问题。自82年Gratzer制备出抗BrdU单抗及标记检测技术后，应用BrdU标记的敏感性已与氘胸腺嘧啶核苷（3H-TdR）相似，而成为取代同位素的非放射性标记物之一。通常使用免疫组化方法定量或定性检测其标记，反映细胞繁殖、细胞周期和DNA合成以及含量等。

产品内容

标记液（Reagent A） 微升

清理液（Reagent B） 毫升

固着液（Reagent C） 毫升

封阻液（Reagent D） 毫升

抗体液（Reagent E） 毫升

染色液（Reagent F） 毫升

复染液（Reagent G） 毫升

抗淬灭液（Reagent H） 微升

产品说明书 1份

保存方式

保存标记液（Reagent A）、固着液（Reagent C）、封阻液（Reagent D）、抗体液（Reagent E）、染色液（Reagent F）、复染液（Reagent G）和抗淬灭液（Reagent H）在－20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里；抗体液（Reagent E）和染色液（Reagent F）严禁反复冻融；标记液（Reagent A）、染色液（Reagent F）、复染液（Reagent G）和抗淬灭液（Reagent H）避免光照；有效保证6月

BrdU

用户自备

60mm细胞培养皿：用于细胞培养的容器

载玻片：用于细胞生长或涂片

盖玻片：用于封片孵育

胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液（）：用于细胞脱离

完全细胞培养液（）：用于中和胰蛋白酶的处理

15毫升锥形离心管：用于细胞收集的操作

台式离心机：用于细胞收集的操作

培养箱：用于细胞染色孵育

荧光显微镜：用于细胞荧光观察

实验步骤

方法一：载玻片贴壁细胞检测

实验开始前，将－20℃冰箱里试剂盒中的试剂置入冰槽里融化。然后进行下列操作：

1． 准备1个60 mm细胞培养皿，内置1个载玻片或盖玻片

2． 接种待测细胞（2 X 106细胞），直至细胞铺满率达到50％

3． 小心抽去细胞培养液

4． 加入xx毫升新鲜的用户自备的完全细胞培养液

5． 加入xx微升标记液（Reagent A），避免光照

6． 轻轻摇动培养板，混匀

7． 放进37℃细胞培养箱孵育90分钟，避免光照

8． 小心抽去含有标记液（Reagent A）的细胞培养液

9． 加入xx毫升清理液（Reagent B），铺满培养表面

10．小心抽去清理液（Reagent B）

11．重复实验步骤9至10二次

12．加入5毫升－20℃预冷的固着液（Reagent C）

13．置于－20℃冰箱里孵育20分钟

14．小心抽去固着液（Reagent C）

15．空气中晾干

16．加入xx微升清理液（Reagent B），铺满载玻片培养表面

17．室温下孵育2分钟

18．小心抽去清理液（Reagent B）

19．加入xx微升封阻液（Reagent D），铺满载玻片培养表面

20．置于37℃培养箱里孵育30分钟，保持湿润

21．小心抽去封阻液（Reagent D）

22．加入xx微升抗体液（Reagent E），铺满载玻片培养表面

23．盖上盖玻片，置于37℃培养箱里孵育30分钟（注意：避免气泡）

24．小心移去盖玻片，抽去抗体液（Reagent E）

25．加入xx微升清理液（Reagent B），铺满载玻片培养表面

26．置于45℃培养箱里孵育5分钟，保持湿润

27．小心抽去清理液（Reagent B） 2

28．重复实验步25至27二次

29．加入xx微升染色液（Reagent F），铺满载玻片培养表面

30．盖上新的盖玻片，置于37℃培养箱里孵育30分钟，避免光照（注意：避免气泡）

31．小心移去盖玻片，抽去染色液（Reagent F）

32．加入xx微升清理液（Reagent B），铺满载玻片培养表面

33．置于45℃培养箱里孵育5分钟，保持湿润

34．小心抽去清理液（Reagent B）

35．重复实验步32至34二次

36．加入xx微升复染液（Reagent G），铺满载玻片培养表面

37．室温下孵育3分钟，避免光照

38．小心抽去复染液（Reagent G）

39．加xx微升抗淬灭液（Reagent H）

40．盖上盖玻片或封片

41．即刻在荧光显微镜下观察

方法二：悬浮细胞涂片检测

实验开始前，将－20℃冰箱里试剂盒中的试剂置入冰槽里融化。然后进行下列操作：

1． 准备1个60 mm细胞培养皿的细胞（2 X 106细胞）

2． 直至细胞铺满率达到50％

3． 小心抽去细胞培养液

4． 加入xx毫升新鲜的用户自备的完全细胞培养液

5． 加入xx微升标记液（Reagent A），避免光照

6． 轻轻摇动培养板，混匀

7． 放进37℃细胞培养箱孵育90分钟，避免光照

8． 小心抽去含有标记液（Reagent A）的细胞培养液

9． 加入xx毫升用户自备的胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液

10．放进37℃细胞培养箱孵育1分钟

11．加入3毫升用户自备的完全细胞培养液

12．移取细胞悬液到15毫升锥形离心管（注意：悬浮细胞从这一步骤开始）

13．放进台式离心机离心10分钟，速度为400g（或1500rpm，例如EPPENDORF 5810R）

14．小心抽去上清液

15．加入xx毫升－20℃预冷的固着液（Reagent C），混匀细胞颗粒群

16．放进台式离心机离心10分钟，速度为400g（或1500rpm，例如EPPENDORF 5810R）

17．小心抽去固着液（Reagent C）

18．重复实验步骤15至17一次

19．加入xx微升固着液（Reagent C），混匀细胞颗粒群（注意：可以长期保存在－20℃冰箱里） 3

20．（选择步骤）细胞计数（使用固着液（Reagent C）调整细胞到1 X 107细胞/毫升）

21．使用200微升枪头移取细胞悬液，同时并排放上5至10张载玻片

22．从高达30至60厘米处向下滴上1至3滴细胞悬液在载玻片上，立即吹散开

23．（替代步骤）可以滴上10微升细胞悬液在载波片上，然后推片

24．室温下静置10分钟，或直至空气中晾干载玻片 （注意：可以保存在70％酒精里，放进4℃冰箱长达数月）

25．加入xx微升清理液（Reagent B），铺满载玻片培养表面

26．室温下孵育2分钟

27．小心抽去清理液（Reagent B）

28．加入xx微升封阻液（Reagent D），铺满载玻片培养表面

29．置于37℃培养箱里孵育30分钟，保持湿润

30．小心抽去封阻液（Reagent D）

31．加入xx微升抗体液（Reagent E），铺满载玻片培养表面

32．盖上盖玻片，置于37℃培养箱里孵育30分钟（注意：避免气泡）

33．小心移去盖玻片，抽去抗体液（Reagent E）

34．加入xx微升清理液（Reagent B），铺满载玻片培养表面

35．置于45℃培养箱里孵育5分钟，保持湿润

36．小心抽去清理液（Reagent B）

37．重复实验步34至36二次

38．加入xx微升染色液（Reagent F），铺满载玻片培养表面

39．盖上新的盖玻片，置于37℃培养箱里孵育30分钟，避免光照（注意：避免气泡）

40．小心移去盖玻片，抽去染色液（Reagent F）

41．加入xx微升清理液（Reagent B），铺满载玻片培养表面

42．置于45℃培养箱里孵育5分钟，保持湿润

43．小心抽去清理液（Reagent B）

44．重复实验步41至43二次

45．加入xx微升复染液（Reagent G），铺满载玻片培养表面

46．室温下孵育3分钟，避免光照

47．小心抽去复染液（Reagent G）

48．加入xx微升抗淬灭液（Reagent H）

49．盖上盖玻片或封片

50．即刻在荧光显微镜下观察

注意事项

1． 本产品为10次操作量

2． 在整个操作过程中须戴手套，以防污染 4

3． 孵育时，须避免光照

4． 载玻片必须非常洁净，且要冷冻后使用

5． 建议从高处滴落样品，可以使细胞舒展开来，便于观察

6． 建议细胞染色完成后，即刻进行荧光显微镜观察。如果放进4℃冰箱里待测，不要超过3天

7． 本公司提供系列细胞凋亡和衰老检测试剂产品

质量标准

1． 本产品经鉴定性能稳定

2． 本产品经鉴定荧光清晰