主要用途

通用型细胞培养污染性支原体属鉴定16S rDNAPCR扩增检测试剂是一种旨在根据保守性序列设计引物，针对支原体样本DNA进行PCR扩增，进一步电泳检测其特异性条带，确认支原体污染的权威而经典的技术方法。该技术由大师级科学家精心研制、成功实验证明的。其适用于各种生物样品，尤其是人体和动物细胞培养中支原体属污染检测。产品即到即用，性能稳定，操作简便，扩增效率显著。

技术背景

支原体（mycoplasma）属于柔膜细菌目（Mollicutes），是最小（0.2至2微米）也是最简单（580至2200kbp）的寄生类生物。其缺乏肽聚糖（peptidoglycan）细胞壁。支原体是人体非典型型肺炎的病原体。由于支原体具有青霉素和链霉素抗性、无法通过过滤去除，成为细胞培养中常见的污染微生物：改变细胞表型和生长特征。其中占80至90%的细胞培养污染性支原体是发酵支原体（M.fermentans）、猪鼻支原体（M.hyorhinis）、口腔支原体（M.orale）、人型支原体（M.hominis）、精氨酸支原体（M.arginini）和莱氏无胆甾原体（A.laidlawii）等。16SrRNA作为非培养依赖性标记的分子指模（fingerprinting）技术，有别于传统的耗时且难以培养存活的选择性培养技术，用于研究微生物的分类学（phylogenetics）。核糖体RNA（ribosome RNA）存在于所有微生物体内，且结构与功能进化保留；容易分离和识别；其一级和二级结构具有高度进化保守区域（conserved region）和物种特异性可变区域（variable region）；其基因序列变异非常缓慢，且不会发生平行基因转移（horizontal gene transfer）。其包括5S、16S、23S。其中16S以及16S和23S之间的交接区域特异性强。通过引物设计，扩增产物，在凝胶电泳上呈现特异性条带，或进一步测序，数据库对照，确定支原体种系（species）。

产品内容

扩增液（Reagent A） xx微升

引物液（Reagent B） xx微升

补充液（Reagent C） xx毫升

测序引物（Reagent D） xx微升（另购）

产品说明书 1份

保存方式

保存在－20℃冰箱里；有效保证6月

用户自备

PCR级矿物油：用于封隔反应液

PCR仪：用于样品扩增

PCR管或平板：用于PCR反应的容器

产品说明书

琼脂糖凝胶电泳：用于扩增后电泳分析

实验步骤

实验开始前，从－20℃冰箱中取出试剂，放进冰槽里融化。然后进行下列操作：

一、 样品准备

1. 移取1毫升细胞培养液上清到1.5毫升离心管

2. 放进微型台式离心机瞬时离心10秒

3. 小心移取上清液到新的1.5毫升离心管

4. 放进微型台式离心机离心10分钟，速度为16000g（或13000RPM；例如eppendorf 5415）

5. 小心抽去上清液，保留沉淀颗粒（注意：肉眼难以见到颗粒）

6. 加入xx微升补充液（Reagent C），枪头抽吸混匀

7. 放进95℃干式恒温仪孵育3分钟

8. 放进-20℃冰箱里保存或置于冰槽里备用

二、扩增反应

1． 针对一个样本，每次移出xx微升扩增液（Reagent A）到PCR管

2． 加入xx微升用户自备的的待测DNA样品（最低量10皮克）

3． 加入xx微升引物液（Reagent B）

4． 再加入xx微升补充液（Reagent C）（反应总量为25微升）

5． 即刻放进微型台式离心机瞬时离心5秒

6． （选择步骤）加入50微升用户自备的PCR级矿物油（注意：参见注意事项13）

7． 即刻进行热启动PCR反应：

温度（℃）

时间

循环

95

2分钟

95

55

70

1分钟

1分钟

2分钟

40

70

5分钟

8． 反应完毕后，移取xx微升进行1.5%琼脂糖凝胶电泳：产物为280bp

9． 如果继续测序鉴定，胶回收PCR产物（建议使用高质纯化胶回收试剂盒；）

10．移出xx微升用户自备的测序反应液到新的1.5毫升离心管

11．加入xx微升测序引物（Reagent D）

12．进行后续的测序反应

注意事项

1． 本产品为20次操作

2． 本产品不适宜于临床组织样本和细菌样本的支原体检测 2

3． 本产品可以检测40多种支原体种系，包括M.fermentans、M.hyorhinis、M.arginini、M.orale、M.salivarium M.hominis、M.pulmonis、M.arthritidis、M.bovis、M.pneumoniae、M.pirum、M.capricolum、U.urealyticum、M.neurolyticum、M.genitalium、M.neurolyticum、M.cullis、M.muris、A.laidlawii和Spiroplasma 等

4． 操作时，须戴手套

5． 建议使用带滤芯的枪头，避免污染

6． 如果要获得高质DNA样品，建议使用DNA纯化试剂盒

7． 在－20℃冰箱里储存的产品避免反复冻融

8． 可以直接使用纯化的基因组DNA进行测序

9． 可以将扩增产物纯化后，克隆到质粒中，然后进行测序

10．根据用户PCR仪的性能，决定是否加入矿物油（Mineral Oil）

11．建议使用软件测算Tm温度；参考公式为Tm=4（G+C）+2（A+T）

12．本公司提供常见种属专一性支原体16SrDNA PCR扩增检测试剂盒

13．如果测序，其序列分析和微生物分类分析工具参考如下：

1）样品序列与数据库已知微生物序列的比对（BLAST）

2）16SrRNA数据库

14．本公司提供系列支原体检测试剂产品

质量标准

1． 本产品经鉴定性能稳定

2． 本产品经鉴定无核酶污染

3． 本产品经鉴定检测准确