细胞培养污染性支原体荧光染色鉴定试剂是一种旨在通过特异性 DNA 活性染料特异性地使固着处理的核酸物质立刻染色，呈现点状或杆状的非核DNA蓝色荧光的权威而经典的技术方法。该技术由大师级科学家精心研制、成功实验证明的。其适用于各种人体和动物细胞培养的支原体定性检测。产品严格无菌，即到即用，性能稳定，检测敏感，荧光清晰。

技术背景

支原体（mycoplasma）属于柔膜细菌目（Mollicutes），是最小（0.2至2微米）也是最简单（580至2200kbp）的寄生类生物。其缺乏肽聚糖（peptidoglycan）细胞壁。支原体是人体非典型型肺炎的病原体。由于支原体具有青霉素和链霉素抗性、无法通过过滤去除，成为细胞培养中常见的污染微生物：改变细胞表型和生长特征。赫斯特染料（Hoechst 33258）为特异性 DNA 活性染料，与 A-T 键结合，这种染料对固着处理的核酸可立即染色。细胞培养污染性支原体荧光染色技术，通过Hoechst 33258DNA染色，替代支原体培养技术，具有快速原位检测细胞培养中支原体的存在，即细胞核外DNA或细胞外DNA的染色阳性， 在荧光显微镜下（激发波长360nm，散发波长490nm）下观察到蓝色点状（dots）或杆状（rods）。

产品内容

清理液（Reagent A） 毫升

固着液（Reagent B） 毫升

染色液（Reagent C） 毫升

封片液（Reagent D） 毫升

产品说明书 1份

保存方式

保存固着液（Reagent B）和染色液（Reagent C）在-20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里；固着液（Reagent B）确保瓶盖密闭；染色液（Reagent C），避免光照，有效保证6月

用户自备

微型台式离心机：用于悬浮细胞操作

细胞培养板或培养皿：用于培养细胞的容器

荧光显微镜：用于观察荧光染色情况

细胞培养污染性支原体荧光染色鉴定试剂盒产品说明书

实验步骤

一、 贴壁细胞培养检测

1． 准备好待测细胞培养至50％铺满率（注意：建议使用无抗生素细胞培养液）

2． 小心抽掉细胞培养容器里的培养液

3． 轻轻加入适量的到每个培养孔里

4． 小心抽去清理液

5． 小心加入适量的到每个培养孔里（见实验步骤2表）

6． 室温下孵育10分钟

7． 小心抽去固着液

8． 重复实验步骤5至7一次

9． 小心加入适量的到每个培养孔里（见下表）

10．在室温下，暗室里孵育30分钟（注意：避免液体蒸发而干枯）

11．小心抽去染色液

12．小心加入适量的到每个培养孔里（见实验步骤2表）

13．小心抽去净化液

清理液（Reagent A）

固着液（Reagent B）

染色液（Reagent C）

清理液（Reagent A）

14．小心加入适量的到每个培养孔里（见实验步骤9表）

15．置于荧光显微镜下观察染色情况（400至1000倍放大倍数）：激发波长360nm，散发波长490nm

胞浆内或细胞外呈现点状、杆状、散粒、纤丝状等蓝色荧光

二、悬浮细胞培养检测

1． 将待测悬浮细胞（1 X 105总量）移入到2毫升离心管

2． 放进微型台式离心机离心5分钟，速度为500g（或2000RPM，例如eppendorf 5415）

3． 小心抽去上清液

4． 加入 毫升，混匀细胞颗粒群

5． 放进微型台式离心机离心5分钟，速度为500g（或2000RPM，例如eppendorf 5415）

6． 小心抽去上清液

7． 加入 毫升，混匀细胞颗粒群

8． 室温下孵育10分钟

9． 放进微型台式离心机离心5分钟，速度为500g（或2000RPM，例如eppendorf 5415）

10．小心抽去上清液

11．重复实验步骤7至10一次

12．加入 毫升，混匀细胞颗粒群

13．室温下，暗室里孵育30分钟

14．放进微型台式离心机离心5分钟，速度为500g（或2000RPM，例如eppendorf 5415）

15．小心抽去上清液

16．加入 毫升，混匀细胞颗粒群

17．放进微型台式离心机离心5分钟，速度为500g（或2000RPM，例如eppendorf 5415）

18．小心抽去上清液

19．加入 微升，混匀细胞颗粒群

20．移取20微升到载玻片上

21．空气中晾干

22．加入 微升

23．封片

24．即刻置于荧光显微镜下观察染色情况（400至1000倍放大倍数）：激发波长360nm，散发波长490nm

胞浆内或细胞外呈现点状、杆状、散粒、纤丝状等蓝色荧光

注意事项

1． 本产品为20次（24孔板）、50次（48孔板）、100次（96孔板）操作

2． 操作时须戴手套

3． 操作时，严格无菌操作

4． 3T6、vero、L292细胞为支原体易感性细胞

5． 建议使用1至3次无抗生素培养传代的待测细胞

6． 试剂瓶务必密封保存

7． 染色液（Reagent C）－20℃低温保存

8． 染色时，避免光照

9． 细胞染色前后的清洗过程中，小心操作，以免将细胞冲洗掉

10．阳性图像可见蓝色发亮的核染色；标准支原体染色见下图： 3

封片液（Reagent D）

清理液（Reagent A）

固着液（Reagent B）

染色液（Reagent C）

清理液（Reagent A）

清理液（Reagent A）

封片液（Reagent D）

11．如果有真菌和细菌污染，可见较大的菌体染色

12．本公司提供系列细胞培养试剂产品

质量标准

1． 本产品经鉴定性能稳定

2． 本产品经鉴定荧光清晰