主要用途

组织氧化应激活性氧羟自由基比色法定量检测试剂是一种旨在通过捕获剂二甲基亚砜，受到羟自由基的氧化，进而与偶氮染料反应，产生黄色产物，由分光光度仪比色分析，来定量检测组织细胞内羟自由基活性氧族的生成和增加的权威而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。适用于各种组织（动物、人体等）裂解悬液的羟自由基检测，以及羟自由基激发剂和抗氧化清除剂（scanvenger）等的检测。可以被用于细胞凋亡、信号传递、衰老、代谢和营养学等的研究。产品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定，显色清晰。

技术背景

超氧自由基阴离子（superoxide radical；O2-）、过氧化氢（hydrogen peroxide；H2O2）、羟自由基或氢氧基（hydroxyl radical；OH-）、过氧化基（peroxyl radical；ROO-）、氢过氧自由基（hydroperoxyl；HOO）、烷氧自由基（alcoxyl radical）、氮氧基（nitric Oxide；NO-）、过氧亚硝基阴离子（peroxynitrite anion；ONOO-）次氯酸（hypochlorous acid；HClO）、半醌自由基（semiquinone radical）、单线态氧气（singlet oxygen）等细胞内活性氧族（Reactive Oxygen Species；ROS）的产生和增多，将导致细胞衰老或凋亡。其中羟自由基或氢氧基具有极度反应性和毒性，同时半衰期短（10－9至10－10秒）。其产生主要是水分子受到高能量放射后裂解、过氧化物和次氯酸反应、过氧化氢的还原、超氧化物的歧化等形成。使用二甲基亚砜（dimethy sulfoxide；DMSO），作为羟自由基的分子探针，捕获羟自由基，并被氧化为甲基亚磺酸（methane sulfinic acid；MSA），在偶氮染料（diazonium dye）的作用下，产生黄色产物偶氮亚砜（diazosulfone），通过分光光度仪（325nm波长），检测未反应棕色成分，以测定羟自由基的含量。据此证明组织细胞内活性氧族的存在。其反应系统为：

DMSO + OH → MSA + CH3

MSA +diazonium dye → diazosulfone + H+

产品内容

清理液（Reagent A）120毫升

标记液（Reagent B）300微升

酸性液（Reagent C）1毫升

染色液（Reagent D）5瓶

净化液（Reagent E） 30毫升

终止液（Reagent F）50毫升

萃取液（Reagent G） 30毫升

稳定液（Reagent H）2.5毫升

标准液（Reagent I） 2毫升

产品说明书1份

保存方式

保存染色液（Reagent D）和标准液（Reagent G）在－20℃冰箱里，避免光照；其余的保存在4℃冰箱里；酸性液（Reagent C）和净化液（Reagent E）具有腐蚀性，注意操作安全；净化液（Reagent E）、萃取液（Reagent F）容易挥发，注意密闭；有效保证6月

用户自备

1.5毫升离心管：用于标准液配制的容器

2.2毫升离心管：用于样品操作的容器

5毫升玻璃管：用于样品操作的容器

15毫升锥形离心管：用于样品操作的容器

DOUNCE匀浆器：用于组织细胞裂解

（微型）台式离心机：用于样品操作

1毫升1厘米光径石英或玻璃比色皿：用于比色分析的容器

分光光度仪：用于比色分析

实验步骤

一、样品准备

1． 手术取出动物组织，并秤重以确定500毫克组织重量

2． （选择步骤）放进预冷的15毫升锥形离心管

3． （选择步骤）加入3毫升清理液（Reagent A）清洗1次

4． 移入到一个液氮冻存管

5． 即刻放进液氮罐过夜

6． 次日从液氮罐里取出，即刻（最快速度）用研磨棒碾碎组织成粉末状（注意：切莫使组织冻融）

7． 放进一个15毫升锥形离心管

8． 加入1毫升清理液（Reagent A）

9． 强力涡旋震荡15秒

10． 即刻放入预冷的DOUNCE匀浆器

11． 在冰槽里用研磨棒匀化组织（约80下）

12． 将所有组织匀浆物移入1.5毫升锥形离心管

13． 放进4℃台式离心机离心5分钟，速度为10000g

14． 小心移取3毫升上清液到新的预冷的1.5毫升锥形离心管

15． 移取10微升进行蛋白定量检测（注意：建议使用Bradford蛋白质浓度定量试剂盒－）

16． 即刻放进－70℃保存或置于冰槽里继续后续操作

二、标准样品配制

1． 准备好5个1.5毫升离心管，标记为1至5号管

2． 分别加入450微升清理液（Reagent A）到2至5号管

3． 移取900微升标准液（Reagent I）到1号管

4． 小心移取450微升1号管的标准液（Reagent I）到2号管，混匀

5． 小心移取450微升2号管稀释的标准液（Reagent I）到3号管，混匀

6． 小心移取450微升3号管稀释的标准液（ReagentI）到4号管，混匀

7． 将1至5号管放进冰槽里备用，避免光照；标准管浓度见下表