考马斯亮蓝法测蛋白含量测定试剂盒说明书
微量法 100T/96S
注意：正式测定之前选择 2-3 个预期差异大的样本做预测定，蛋白浓度在
0~1000µg/ml 范围内。
测定意义：
样品可溶性蛋白质含量常常用于酶活性计算。此外，可溶性蛋白质含量也用于食品等质量分
析。
测定原理：
在酸性溶液中，考马斯亮蓝 G-250 与蛋白质结合形成蓝色复合物；该复合物在 595nm 处有
大吸收峰， 其颜色的深浅与蛋白质的浓度成正比。该方法灵敏度，适合微量蛋白质分
析。
自备仪器和用品：
离心机、可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96 孔板、移液器和蒸馏水。
试剂组成和配制：
试剂一：液体×1 瓶，4℃保存。
标准品：液体×1 瓶，4℃保存。
样品中可溶性蛋白质提取：
1. 液体样品：澄清液体样品可以直接测定。
2. 组织样品：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g
组织，加入 1mL 提取液（自备，根据需要选用酶提取缓冲液或者蒸馏水或者生理盐水））
冰浴匀浆，8000g，4℃离心 10min，取上清，即待测液。（动物样品常常需要稀释）
3. 细菌、真菌：按照细胞数量（104 个）：提取液体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建
议 500 万细胞加入 1mL 提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率 300w，超声 3 秒，间隔 7
秒，总时间 3min）；然后 8000g，4℃，离心 10min，取上清置于冰上待测。
测定操作：
1. 分光光度计/酶标仪预热 30 min，蒸馏水调零。
2. 空白管：取 EP 管，加入 40μL 蒸馏水，250μL 试剂一，混匀后室温静置 10min，取 200μL
于微量石英比色皿/96 孔板，于 595nm 比色，10~20min 完成比色，记为 A 空白管。
3. 标准管：取 EP 管，加入 40μL 标准液，250μL 试剂一，混匀后室温静置 10min，取 200μL
于微量石英比色皿/96 孔板，于 595nm 比色，10~20min 完成比色，记为 A 标准管。
4. 测定管：取 EP 管，加入 40μL 待测液，250μL 试剂一，混匀后室温静置 10min，取 200μL
于微量石英比色皿/96 孔板，于 595nm 比色，10~20min 完成比色，记为 A 测定管。
注意：空白管和标准管只需要测定一次。
计算公式：
Cpr（µg/mL）= C 标准管×(A 测定管－A 空白管)÷(A 标准管－A 空白管)
=50×(A 测定管－A 空白管)÷(A 标准管－A 空白管)
C 标准管：标准品蛋白质浓度，50μg/mL。
注意事项：
1.加考马斯亮蓝后，在 10~20min 内吸光值相对较稳定，因此须在 10~20min 完成比色。
2.不宜用石英比色皿，可用玻璃或塑料比色皿，测完成后立即用 95%乙醇冲洗。
3.测定前用 1~2 个样做预实验，蛋白浓度在 0~1000µg/ml 范围内，否则需要做相应稀释，
使得稀释后的结果在 0~1000µg/ml 范围内，然后在计算公式中再乘以稀释倍数。