【产品名称】
通用名称：乙型脑炎病毒检测试剂盒（实时荧光 PCR 法）
英文名称：Japanese encephalitis virus Detection Kit (Real-Time PCR Method)
【包装规格】25T/盒 & 50T/盒
【预期用途】
本试剂盒利用实时荧光 PCR 原理，定性检测乙型脑炎病毒，对乙型脑炎病毒引起的感染及其并发症的诊断及疗
效评估有重要指导意义。
【检验原理】
本试剂盒针对 JEV 基因组高度保守区域设计特异性引物和探针，在反应体系中含 JEV 基因组模板的情况下，
PCR 反应得以进行并释放荧光信号。利用仪器对 PCR 过程中相应通道的信号强度进行实时监测和输出，实现检测
结果的定性分析。
【主要组成成份】
序号 组成 25 人份/盒 50 人份/盒
1 JEV RT-PCR 反应液 375 μL×1 管 750 μL×1 管
2 JEV 逆转录酶 50 μL×1 管 100 μL×1 管
3 JEV Taq 酶 75 μL×1 管 150 μL×1 管
4 JEV 阳性对照 40 μL×1 管 40 μL×1 管
5 JEV 阴性对照 40 μL×1 管 40 μL×1 管
6 说明书 1 份 1 份
注：阴性对照为人基因组 DNA，阳性对照为失去活性的 JEV cDNA。
【储存条件及有效期】避光-20℃以下保存，避免反复冻融，有效期 12 个月。
【适用仪器】ABI 系列、Bio-Rad 系列、Agilent Stratagene MX 系列 、Roche LightCycler R480、Cepheid SmartCycler、
Rotor-Gene 系列、杭州博日系列等多通道实时荧光定量 PCR 仪。
【样本要求】
1.从血清或脑脊液获取样本。
2.应避免标本间交叉污染。
6.样品如不及时检测，应于-20℃至-80℃冻存。标本运输应于冷冻条件下进行
【检验方法】
1. 试剂准备（试剂准备区）
（1）从冰箱中取出试剂盒, 从试剂盒中取出实验所需试剂,充分融化混匀并瞬时离心以去除管壁附着液体。
（2）核算当次实验所需要的反应数（n），并根据如下表所示反应体系计算当次实验所需要的各种试剂量。
n =阴性对照数（1T）+阳性对照数（1T）+误差预留量（1T）+样本数
单反液配制表(每人份)
RT-PCR 反应液 15.0 μL
逆转录酶 2.0 μL
Taq 酶 3.0 μL
(3)在无菌离心管中加入上述试剂，充分混匀后瞬时离心。按照 20 μL/管分装量将试剂分装至 PCR 反应管。
2.样本准备（样本处理区）
用 QIAGEN、Roche 公司 RNA 提取试剂盒提取 RNA，具体操作按照其试剂盒说明书操作。
3.加样
在上述制备好的 PCR 反应样本管中分别加入处理好的待测标本 RNA 各 5 μl、终体积 25 μl/管，盖好 PCR 反应
盖混匀后瞬时低速离心，转移到 PCR 仪器上。阴性对照和阳性对照管则各加 5 μL 试剂盒自带的阴性对照或阳性对
照品，终体积为 25 μl/管，盖好 PCR 反应盖混匀后瞬时低速离心，转移到 PCR 仪器上。
（1）取样本处理区准备好的 PCR 反应管，放置在实时荧光定量 PCR 仪样品槽相应位置，并记录放置顺序。
（2）按下表设置仪器核酸扩增相关参数进行 PCR 扩增。
注：ABI 系列荧光 PCR 仪在设置时不选 ROX 校正，设置淬灭基团选择 None。
反应体积 25 μL 通道选择 FAM 通道采集 JEV 荧光信号
PCR
反应
条件
步骤 条件 循环数
反转录 42℃：10 分钟（min） 1
预变性 95℃：3 分钟（min） 1
预扩增
95℃：5 秒（s） 5
55℃：40 秒（s）
PCR 扩增
95℃：5 秒（s）
55℃：40 秒（s） 40
（此阶段结束时采集荧光信号）
乙型脑炎病毒检测试剂盒（实时荧光 PCR 法）说明书
2
【参考值（参考范围）】
1.试剂盒有效性判定：
（1）阳性对照：有典型 S 型扩增曲线或 Ct 值≤35。
（2）阴性对照：Ct 值＞38 或无 Ct 值，线形为直线或轻微斜线，无指数增长期。
2.标本结果判定：
（1）阳性：标本检测结果 Ct 值≤38 或有明显指数增长期。
（2）可疑：标本检测结果 Ct 值在 35～38 范围内。此时应对标本进行重复检测，如重复实验结果 Ct 值仍在 35～
38 范围内，有明显指数增长期，则判定为阳性，否则为阴性。
（3）阴性：标本检测结果 Ct 值＞38 或无 Ct 值。
【检验结果的解释】
通道及检测结果 标本检测结果解释 FAM
阴性（－） 标本中未检出 JEV RNA
阳性（＋） 标本中检测出 JEV RNA
【检验方法的局限性】
1. 当检测样本中被检核酸浓度低于本试剂盒的最低检出限时可能会发生假阴性的结果。
2. 被检样本在采集、运输、储存以及处理过程中操作方式不当容易造成 RNA 降解而产生假阴性结果。
3. 样本在采集、运输、储存以及处理过程中发生交叉污染，则容易得到假阳性结果。
【产品性能指标】 产品的最低检出限为 10
2Copies/mL，产品 CV 值≤5%。
【注意事项】
1. 整个检测过程应严格按照本说明书要求分别在试剂准备区、样本处理区和 PCR 扩增区进行操作，各区实验服、
仪器、耗材应独立使用，不能混用；实验用吸头采用带滤芯吸头；样本处理区应配有生物安全柜，样本处理在
生物安全柜中进行操作；三个区应该配有紫外线杀菌装置。
2. 为避免 RNA 降解，样本处理过程应在 0-4℃条件下操作，且完成实验后立即上机检测；样本处理过程中使用的
器具耗材应经过无核酶处理。
3. 每次实验应该设置阴、阳性对照。
4. 试剂盒所有试剂在使用前应该在常温下充分融化混匀，并应瞬时离心。
5. 试剂盒内所配阴性和阳性对照在第一次使用前应全部转移至标本准备区，并单独存放。
6. 为防止荧光干扰，应避免裸手直接接触 PCR 反应管，并应避免在 PCR 反应管上进行任何标记。
7. 仪器扩增相关参数应按照本说明书相关要求进行设置；不同批号试剂不能混用。
8. ABI 系列荧光定量 PCR 仪参数设置中不选 ROX 校正，淬灭基因选择 None。
9. 实验过程中产品的废弃物应该进行无害化处理后方可丢弃。
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