小鼠海马神经元细胞的组织来源于实验小鼠的正常脑组织，因为海马神经元细胞类似于干细胞属于高分度分化的细胞特性，具有不能传代，不能增殖等特点，所有收到细胞后尽快使用。

1.试验所需仪器设备及试剂

（1）仪器

生物安全柜

CO2细胞培养箱

荧光倒置显微镜

高速冷冻离心机

电热恒温鼓风干燥箱

（2）试剂耗材

T25细胞培养瓶

血球计数板

细胞培养孔板

红细胞裂解液

神经元完全培养基

0.25%胰蛋白酶（含0.02%EDTA）

多聚甲醛（PFA）

DAPI

Triton X-100

山羊血清

NSE

Goat anti-Rabbit lgG（H+L）

Cross-Adsorbed Secondary antibody，Alexa Fluor 594

Fluoromount-G荧光封片剂

2.分离培养方法

1) 取1-10 d的新生小鼠。用75%的乙醇浸泡，

2) 在冰浴的PBS中分离海马，PBS洗涤3次，剪碎，

3) 用0.25% Trypsin + 0.1% Ⅰ型胶原酶37℃水浴振荡消化30min，

4) 用FBS终止消化，轻轻吹打，

5) 过100 μm 滤网，

6) 收集滤液，300 g离心5 min，

7) 用完全培养基重悬沉淀，铺瓶。

3.免疫荧光

3.1.实验步骤

（1）细胞爬片

取3片玻璃片于24孔板中，每孔加入培养基1mL，加入细胞0.02million个/孔。置培养箱2h或过夜。

（2）固定

细胞爬片后，吸出培养基，用PBS洗1遍，加入4% PFA于4℃固定30min。用PBS洗3×5min/次。也可最后一次不吸出PBS，放4℃过夜。

（3）破膜封闭

将玻片除去水分，置于培养皿支撑物上，

玻璃片封闭液配置：0.5% Trition X-100与PBS 1:1混合，再加10% 血清，

取50uL破膜封闭液滴于防水膜上，将玻片上有细胞的一面盖上2h。

（4）一抗孵育

一抗配制：抗体与PBS 1:100（200）稀释

破膜封闭后，取50uL一抗于防水膜上（湿盒中），将玻片（有细胞的一面）盖上置于4℃（最多可放置一周）

（5）二抗孵育

室温避光孵育二抗（二抗:PBS=1:500）2h后，PBS洗3×5min/次，染DAPI（DAPI:PBS=1:1000）5min，PBS洗3×5min/次。

（6）包埋

玻片上各滴1滴Fluoromount-G，将有细胞的一面盖上。

鉴定细胞为P1代细胞

3.2.检测结果

（1）细胞免疫荧光鉴定照片

阴性

100X-DAPI 100X-Fluorescence

NSE

100X-DAPI 100X-Fluorescence

（2）检验基本情况：

经免疫荧光鉴定，该细胞纯度达到90%以上。