以下所有步骤均可在室温下进行：

1．挑取单克隆培养至12-16h，然后取1.5-3ml 细菌培养物于EP 管中，10000g 离心1 分钟，去上清液，使细菌沉淀尽量干燥；

2．将细菌沉淀重悬于250 μl solution I/RNase A 中（该溶液置于4℃保存，使用完后记得放回4℃），彻底混匀；

3．加入250 μl solution II，盖紧EP 管口，快速轻柔颠倒混匀混合物，一般反应2分钟即可，不能超过5分钟。

4．加入300 μl solution III，盖紧EP 管口，快速颠倒数次，13000g离心10min

5．取Hibind Miniprep column放入2ml收集管中，取上清加入该管中（注意不要取到白色沉淀物），10000g离心1分钟。

6．去掉离心后收集管中的溶液，加500μl buffer HB，10000g离心1分钟。

7．去掉离心后收集管中的溶液，加700μl DNA Wash buffer（使用前确认该溶液已按比例用酒精稀释过，如果冬天进行实验，DNA Wash Buffer可能因温度过低有沉积，需升温溶解上下颠倒混匀后才可使用），10000g离心1分钟。

8．重复步骤7。

9．倒掉离心后收集管中的溶液，13000g离心2分钟（离心完后确认Hibind Miniprep column侧壁底部有无溶液，如有，应该用细长滤纸或10ul枪头吸干净后再离心一次）。

10．将柱子放入干净的离心管中，加入30-50μl Elution buffer或双蒸水（加入时应该加在滤膜中央，但又要避免枪头碰到滤膜，以免戳穿。另，如果长期保存，建议加入Elution buffer），静置2分钟，13000g离心1分钟收集质粒。

11．琼脂糖电泳检测或通过测A260来估算浓度：质粒DNA= A260X50X（稀释倍数）ug/ml。