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PAGE胶DNA纯化回收试剂盒
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详细内容
中文名称:PAGE胶DNA纯化回收试剂盒
英文名称:PAGE DNA Extraction Kit
产品规格:50次
产品货号:GOY-F9781
| 本试剂盒采用新型硅基质膜离心柱及特殊的缓冲液系统,可从聚丙烯酰胺凝胶中简捷高效回收20bp~500bp的短片段DNA段,回收效率可高达85%。并可大限度去除杂质,获得高纯度的DNA,所得到的DNA可直接用于酶切、连接、测序等后续的分子生物学试验。 产品特点: 适用范围广泛,可以回收20bp~2kb的单链或者双链DNA。 使用了优质结合液,不含传统结合液的碘钠和高氯酸盐,不抑制回收后酶切、连接克隆等下游反应。 独特的配方保证了该试剂盒比一般试剂盒回收效率大大提高。 快速、方便离心柱型,不需要使用有毒的、等试剂,也不需要乙醇沉淀。 保存:RT,有效期12个月 注意事项: 避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、pH值变化,各溶液使用后应及时盖紧盖子。 所有的离心步骤均在室温完成,使用转速可以达到13,000rpm的传统台式离心机。 结合液中含有刺激性化合物,操作时要戴乳胶手套,避免沾染皮肤,眼睛和衣服。若沾染皮肤、眼睛时,要立即用大量清水或者生理盐水冲洗。 电泳时好使用新的电泳缓冲液,以免影响电泳和回收效果。 切胶时,紫外照射时间应尽量短,以免对DNA造成损伤。也可以选择可见光染料染色后在可见光下切胶会避免紫外对DNA损伤。 回收率与片段大小、凝胶浓度、初始DNA量和洗脱体积有关。 操作步骤: 提示:第yi次使用请先在漂洗液WB中加入量无水乙醇,加入后请及时打钩标记已加入乙醇,以免多次加入! 切取含DNA段的PAGE凝胶(100mg左右,尽可能多地把多余的胶切除,否则会影响回收效率),放入1.5mL离心管中,用移液枪头尽可能捣碎(好先在酒精灯上将枪头的口烧密闭再用于捣碎),捣得越细越好。 向凝胶中加入1-2倍体积的Diffusion Buffer (如100mg凝胶加入100-200μL Diffusion Buffer),55℃温浴30分钟-2小时,期间每15分钟涡旋震荡混匀,促进胶中DNA扩散到溶液中。 一般来说,回收片段越大,DNA扩散需要的时间越长,100bp左右的DNA段温浴30分钟就可以(时间长些也不影响回收效果); 如果回收500bp-1000bp的DNA段,可以将温浴时间延长3-5个小时。也可以37℃温浴12-16小时过夜。 12,000rpm离心5分钟。小心取上清转入新的离心管。记录上清体积。 加入9倍上清体积的Binding Buffer,混匀。回收片段>100bp时,加5倍上清体积的Binding Buffer即可。 将上一步所得溶液加入吸附柱EC中(吸附柱放入收集管中),室温放置1分钟,12,000rpm离心30-60,倒掉收集管中的废液。吸附柱大容积为750μL,若溶液体积大于750μL,可分批加入。 加入600μL漂洗液WB(请先检查是否已加入无水乙醇!),12,000rpm离心30,弃掉废液。 重复步骤6一遍。 将吸附柱EC放回空收集管中,13,000rpm离心2分钟,尽量除去漂洗液,以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。 取出吸附柱EC,放入一个干净的离心管中,在吸附膜的中间部位加30-50μL洗脱缓冲液EB,室温放置2分钟,12,000rpm离心1分钟。如果需要较高浓度核酸,可将得到的溶液重新加入吸附柱中,离心1分钟。 洗脱体积越大,洗脱效率越高。如果需要核酸浓度较高,可以适当减少洗脱体积,但是小体积不应少于25μL,体积过小降低核酸洗脱效率,减少产量。 |
1) 由于细胞凋亡是一个快速的过程,建议样品在染色后1小时之内进行分析。
2) 对于贴壁细胞,消化是一个关键步骤。贴壁细胞诱导细胞凋亡时如有漂浮细胞,需收集漂浮细胞和贴壁细胞后合并染色。处理贴壁细胞时要小心操作,尽量避免人为的损伤细胞。*消化时间过短,细胞需要用力吹打才能脱落,容易造成细胞膜的损伤,PI摄入过多;消化时间过长,细胞膜同样易造成损伤,甚至会
影响细胞膜上磷脂酰*与Annexin V-FITC的结合。消化时将*铺满孔板底后,轻摇时*与细胞充分接触,然后倒掉大部分*,利用剩余的少量*再消化一段时间,待细胞间空隙增大,瓶底呈花斑状即可终止。在消化液中尽量不用EDTA,EDTA会影响Annexin V与PS的结合。
3) 实验中如需要固定细胞,比如在检测凋亡的同时检测细胞周期,只能选用Annexin V-FITC,而不能选用Annexin V-EGFP,因为在固定过程中EGFP会变性导致丧失激发荧光的能力。固定需要先将细胞与Annexin V-FITC进行孵育,并用binding buffer洗掉未结合的Annexin V-FITC。因为固定过程中细胞通透性增加会产生细胞碎片,可以和Annexin V结合,对结果产生干扰。
4) 如果样品来源于血液,请务必除去血液中的血小板。因为血小板含有PS,能与Annexin V结合,从而干扰实验结果。可以使用含有EDTA的缓冲剂并在200 g离心洗去血小板。
5) 试剂在开盖请短暂离心,将盖内壁上的液体甩至管底,避免开盖时液体洒落。
6) Annexin V-FITC和PI是光敏物质,在操作时请注意避光。
1.CTAB 溶液在低于15℃时会析出沉淀,因此在将其加入冷冻的植物材料中之必须预热。
2.在适条件下,DNA—CTAB 沉淀呈白色纤维状,很容易一下子就从溶液中钩出。不过,某些植物种的DNA 沉淀中可能含有杂质,特别是多糖,使DNA 沉淀呈絮状或胶状,这种情况下可能需要稍事离心才能得到DNA. —CTAB 沉淀。
3.饱和酚虽然可有效地使蛋白质变性,但酚不能完全抑制RNA 酶的活性,而且酚可以溶解含poLy(A)的mRNA。如果用*和的混合液,可减轻这两种现象,同时可加入适量的异戊醇(*—异戊醇=25:24:1),异戊醇的作用是消泡,并使蛋白质层紧密,使水相和有机相分层较好。 细菌的培养和收集 将含有质粒pBS 的DH5α菌种接种在LB 固体培养基(含50μg/ml Amp)中, 37℃培养12-24 小时。用无菌牙签挑取单菌落接种到5ml LB 液体培养基(含50μg/ml Amp)中,37℃振荡培养约12 小时至对数生长后期。小量提取法对于从大量转化子中制备少量部分纯化的质粒DNA 十分有用。这些方法共同特点是简便、快速,能同时处理大量试样,所得DNA 有一定纯度,可满足限制酶切割、电泳分析的需要。
操作流程:
1.根据要保存的各样本的体积,计算出所需RNAwait用量。RNAwait的用量应当是组织体积的10倍(如100mg组织约用1ml RNAwait);离心收集2×106细胞RNAwait的用量是1ml。
2. 将RNAwait按需要量分装入自备保存管中;
3. 快速将较大的组织切成厚度<0.5 cm的任意片状,立即完全浸入RNAwait中。组织的厚度一定要<0.5 cm。组织过厚则RNAwait不能有效渗入,组织中间部位的RNA不能受到保护。较小的组织(如大鼠的肾脏、脾脏,小鼠的大部分器官)取下后可以直接浸入RNAwait。
4. 保存时先将样本浸入RNAwait后置4℃冰箱过夜(4℃过夜是必需的,这样可使RNAwait完全渗入到组织中),然后转移到-20℃冰箱(RNAwait在-20℃时仍为液态,有结晶析出,是正常情况);或者在4℃冰箱过夜后,从RNAwait中取出组织块,转移到-80℃冰箱。在RNAwait中保存的标本,反复冻融至室温20次不影响RNA的质量。
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