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质粒中量抽提试剂盒(9mL)
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详细内容
1.根据要保存的各样本的体积,计算出所需RNAwait用量。RNAwait的用量应当是组织体积的10倍(如100mg组织约用1ml RNAwait);离心收集2×106细胞RNAwait的用量是1ml。
2. 将RNAwait按需要量分装入自备保存管中;
3. 快速将较大的组织切成厚度<0.5 cm的任意片状,立即完全浸入RNAwait中。组织的厚度一定要<0.5 cm。组织过厚则RNAwait不能有效渗入,组织中间部位的RNA不能受到保护。较小的组织(如大鼠的肾脏、脾脏,小鼠的大部分器官)取下后可以直接浸入RNAwait。
4. 保存时先将样本浸入RNAwait后置4℃冰箱过夜(4℃过夜是必需的,这样可使RNAwait完全渗入到组织中),然后转移到-20℃冰箱(RNAwait在-20℃时仍为液态,有结晶析出,是正常情况);或者在4℃冰箱过夜后,从RNAwait中取出组织块,转移到-80℃冰箱。在RNAwait中保存的标本,反复冻融至室温20次不影响RNA的质量。
产品属性:
中文名称:质粒中量抽提试剂盒(9mL)
英文名称:Plasmid Midi Preparation Kit(9mL)
产品规格:50次
产品货号:GOY-F9721
| 本试剂盒是一种用于从中进行中量质粒快速抽提的离心柱式试剂盒。本试剂盒抽提得到的质粒可直接用于转染细胞,DNA测序,PCR,基于PCR的突变,体外转录,转化细菌,内切酶消化等。 本试剂盒适用于常用的EndA-菌株DH5A、JM109和XL-1 blue等。对于EndA+菌株如JM110、BL21(DE3)、TG1和HB101等,可以顺利完成质粒抽提,但从EndA+菌株中抽提获得的质粒会有轻微的核酸酶污染,如果在内切酶缓冲液中37℃孵育1小时会导致质粒全部降解。从EndA+菌株中抽提质粒时推荐使用我公司的通用型质粒小量抽提试剂盒(YTB4001)、通用型质粒中量抽提试剂盒(YTB4002)和通用型质粒大量抽提试剂盒(YTB4003)。 野生型中表达Endonuclease I,能切割并降解双链DNA。编码Endonuclease I的基因是endA,如果endA突变失活,其基因型会被标注为endA1,相应的突变菌株被称为EndA-菌株,而野生型菌株则被称为EndA+菌株。常见的EndA-和EndA+菌株参见附表1。从EndA+菌株中抽提的质粒,微量核酸酶和质粒结合而容易被共纯化,导致容易降解。 本试剂盒采用了一种新型的离子交换柱。在特定条件下,使质粒能在离心过柱的瞬间,结合到质粒纯化柱上,在一定条件下又能将质粒充分洗脱,从而实现质粒的快速纯化。无需酚抽提,无需酒精沉淀,12个样品只需不足60分钟即可完成。 无需高速冷冻离心机,只需普通台式高速离心机。所有操作均可在1.5mL离心管中完成。 每个质粒纯化柱可以结合的质粒量的上限约为50μg。每个纯化柱可用于抽提5~10mL用LB培养过夜的。抽提所得质粒的OD260和OD280比值一般在1.80左右。抽提获得的质粒量会受质粒拷贝数等因素影响。抽提获得的质粒DNA的OD260和OD280比值也会因菌种不同等原因而略有波动。 保存条件:室温保存,一年有效。 注意事项: 第yi次使用把试剂盒提供的RNase A全部加到溶液I (悬浮液)中,混匀,并在瓶上做好标记。加入RNase A后4℃存放。 第yi次使用在溶液IV (洗涤液)中加入27mL无水乙醇,混匀,并在瓶上做好标记。 温度较低时,溶液II和溶液III可能会有沉淀产生。使用必须检查一遍。如有沉淀,37℃水浴加热溶解,混匀后使用。溶液II请勿过分剧烈混匀,否则会产生大量气泡。 溶液II使用完后,一定要盖紧瓶盖,防止被空气中二氧化碳酸化。 溶液II有碱性,溶液II和溶液III对人体有刺激性,操作时请小心,并注意适当防护以避免直接接触人体或吸入体内。 本试剂盒所有操作均在室温进行,操作时无需冰浴。所有离心也均在室温进行。 废液收集管在一次抽提中需多次使用,切勿中途丢弃。 使用说明: 取过夜菌至3个1.5mL离心管中,5000g离心1分钟收集细菌沉淀,弃上清。再重复一次,每管共收集3mL过夜菌沉淀。 通常宜用LB培养过夜(16小时左右)至OD值为2-4。建议5000g(通常为5000rpm左右)室温离心1分钟,如沉淀不充分则适当延长离心时间。时间过长或离心速度过快会使沉淀过于紧密,不利于加入溶液I后散开沉淀。直接倒掉上清,再倒入约1.5mL菌液并重复上述操作,然后倒置于吸水纸上(可用普通草纸),使液体流尽。如果细菌密度明显偏低,可考虑使用更多菌液,再重复上述操作1~2次。对于高拷贝质粒所用菌量每管一般不能过5mL,对于低拷贝质粒所用菌量每管一般不能过10mL。过量的菌会导致后续的裂解不充分。 每管加入250μL溶液I,重悬细菌沉淀。确保沉淀完全散开,无可见细菌团块。 确认溶液I中已经添加了RNase A。高速度vortex 5~10或更长时间,悬起沉淀。一定要充分混匀,对着光亮处观察应呈均匀的悬浊液,无明显细菌团块或絮块。如果没有vortex,可以用枪吹打沉淀使沉淀逐渐散开或用手指把沉淀弹开。 每管加入250μL溶液II,轻轻颠倒离心管4~6次,使细菌完全裂解,溶液透明。 切勿vortex!vortex或其它剧烈操作会导致基因组DNA断裂,易导致终所得质粒被基因组DNA污染。颠倒4~6次后,溶液应变得透明,无团块或絮状物。如果加入溶液I后细菌没有完全散开,那么颠倒4~6次后,可能还会有团块或絮状物。遇到有少量团块或絮状物产生的情况,可以增加颠倒次数3~5次,再室温放置2~3分钟,但总裂解时间不可过5分钟。 每管加入350μL溶液III,随即颠倒离心管4~6次混匀,可见白色絮状物产生。 切勿vortex!颠倒次数也不宜过多,否则易导致终所得质粒的质量下降。 高速(13000rpm左右)室温离心10分钟。 离心后会产生白色沉淀。离心时准备好下一步需使用的质粒纯化柱,废液收集管,并在纯化柱上做好标记。 将上一步骤离心后的上清倒入或吸入到质粒纯化柱内。高速离心30~60,倒弃收集管内液体。再重复两次,使三管质粒结合于同一纯化柱上。 质粒倒入质粒纯化柱后,可以不用等待,直接离心。倒弃收集管内的液体后,保留收集管继续使用。 在质粒纯化柱内加入750μL溶液IV,高速离心30~60,洗去杂质,倒弃收集管内液体。 加入溶液IV后可以不用等待,直接离心。倒弃收集管内的液体后,保留收集管继续使用。 再高速离心1分钟,除去残留液体并使痕量乙醇完全挥发。 注意:倒弃收集管内液体后再离心,才能彻底去除微量的溶液IV。微量的溶液IV会影响质粒的质量。 将质粒纯化柱置于洁净1.5mL离心管上,加入120μL溶液V至管内柱面上,放置1分钟。 溶液V需要直接加至管内柱面中央,使液体被纯化柱吸收。如果不慎将溶液V沾在管壁上,一定要震动离心管,使液体滑落到管底,以便被纯化柱吸收。也可以用重蒸水或Milli-Q纯水替代溶液V,但是水的pH应不小于6.5。溶液V加入后放置时间稍长,对于增加质粒产量会略有帮助。 高速离心1分钟,所得液体即为高纯度质粒。 通常所得质粒浓度为0.1~0.3mg/ml左右。如果想得到高浓度的质粒,可以采用常规的乙醇沉淀方法浓缩质粒。 |
1.CTAB 溶液在低于15℃时会析出沉淀,因此在将其加入冷冻的植物材料中之必须预热。
2.在适条件下,DNA—CTAB 沉淀呈白色纤维状,很容易一下子就从溶液中钩出。不过,某些植物种的DNA 沉淀中可能含有杂质,特别是多糖,使DNA 沉淀呈絮状或胶状,这种情况下可能需要稍事离心才能得到DNA. —CTAB 沉淀。
3.饱和酚虽然可有效地使蛋白质变性,但酚不能完全抑制RNA 酶的活性,而且酚可以溶解含poLy(A)的mRNA。如果用*和的混合液,可减轻这两种现象,同时可加入适量的异戊醇(*—异戊醇=25:24:1),异戊醇的作用是消泡,并使蛋白质层紧密,使水相和有机相分层较好。 细菌的培养和收集 将含有质粒pBS 的DH5α菌种接种在LB 固体培养基(含50μg/ml Amp)中, 37℃培养12-24 小时。用无菌牙签挑取单菌落接种到5ml LB 液体培养基(含50μg/ml Amp)中,37℃振荡培养约12 小时至对数生长后期。小量提取法对于从大量转化子中制备少量部分纯化的质粒DNA 十分有用。这些方法共同特点是简便、快速,能同时处理大量试样,所得DNA 有一定纯度,可满足限制酶切割、电泳分析的需要。
原钙黏素α9(PCDHα9)酶联免疫试剂盒N,N'-双(亚水杨基)-1,4-丁烷二 97%γ-亚麻酸 97%砷标准溶液(1000μg/ml,溶剂:1mol/L硝酸)
质粒中量抽提试剂盒(9mL)3-Allylrhodanine
注意事项:
1) 由于细胞凋亡是一个快速的过程,建议样品在染色后1小时之内进行分析。
2) 对于贴壁细胞,消化是一个关键步骤。贴壁细胞诱导细胞凋亡时如有漂浮细胞,需收集漂浮细胞和贴壁细胞后合并染色。处理贴壁细胞时要小心操作,尽量避免人为的损伤细胞。*消化时间过短,细胞需要用力吹打才能脱落,容易造成细胞膜的损伤,PI摄入过多;消化时间过长,细胞膜同样易造成损伤,甚至会
影响细胞膜上磷脂酰*与Annexin V-FITC的结合。消化时将*铺满孔板底后,轻摇时*与细胞充分接触,然后倒掉大部分*,利用剩余的少量*再消化一段时间,待细胞间空隙增大,瓶底呈花斑状即可终止。在消化液中尽量不用EDTA,EDTA会影响Annexin V与PS的结合。
3) 实验中如需要固定细胞,比如在检测凋亡的同时检测细胞周期,只能选用Annexin V-FITC,而不能选用Annexin V-EGFP,因为在固定过程中EGFP会变性导致丧失激发荧光的能力。固定需要先将细胞与Annexin V-FITC进行孵育,并用binding buffer洗掉未结合的Annexin V-FITC。因为固定过程中细胞通透性增加会产生细胞碎片,可以和Annexin V结合,对结果产生干扰。
4) 如果样品来源于血液,请务必除去血液中的血小板。因为血小板含有PS,能与Annexin V结合,从而干扰实验结果。可以使用含有EDTA的缓冲剂并在200 g离心洗去血小板。
5) 试剂在开盖请短暂离心,将盖内壁上的液体甩至管底,避免开盖时液体洒落。
6) Annexin V-FITC和PI是光敏物质,在操作时请注意避光。
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