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革兰氏阳性菌质粒小量提取试剂盒(1~5mL)
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详细内容
1.根据要保存的各样本的体积,计算出所需RNAwait用量。RNAwait的用量应当是组织体积的10倍(如100mg组织约用1ml RNAwait);离心收集2×106细胞RNAwait的用量是1ml。
2. 将RNAwait按需要量分装入自备保存管中;
3. 快速将较大的组织切成厚度<0.5 cm的任意片状,立即完全浸入RNAwait中。组织的厚度一定要<0.5 cm。组织过厚则RNAwait不能有效渗入,组织中间部位的RNA不能受到保护。较小的组织(如大鼠的肾脏、脾脏,小鼠的大部分器官)取下后可以直接浸入RNAwait。
4. 保存时先将样本浸入RNAwait后置4℃冰箱过夜(4℃过夜是必需的,这样可使RNAwait完全渗入到组织中),然后转移到-20℃冰箱(RNAwait在-20℃时仍为液态,有结晶析出,是正常情况);或者在4℃冰箱过夜后,从RNAwait中取出组织块,转移到-80℃冰箱。在RNAwait中保存的标本,反复冻融至室温20次不影响RNA的质量。
产品属性:
中文名称:革兰氏阳性菌质粒小量提取试剂盒(1~5mL)
英文名称:Gram-positive Bacterium Plasmid Extraction Mini Kit(1-5ml)
产品规格:50T|100T
产品货号:GOY-F9761
| 本试剂盒用于Gram+细菌质粒提取,一次可处理1~5mL菌液。 保存:室温保存,复检期一年,其中RNase A,需置于-20℃保存。 注意事项: 使用请先检查溶液Ⅱ和溶液Ⅲ是否出现混浊,如有混浊现象,可在37℃水浴中加热几分钟,待溶液恢复澄清后再使用。 洗脱缓冲液体积不应少于50μL,体积过小影响回收效率;洗脱液的pH值对洗脱效率也有影响,若需要用水做洗脱液应保证其pH值在8.0左右(可用NaOH将水的pH值调至此范围),pH值低于7.0会降低洗脱效率。DNA产物应保存在-20℃,以防DNA降解。 如果所提质粒为低拷贝质粒或大于10kb的大质粒,应加大菌体使用量,使用5~10mL过夜培养物,同时按照比例增加溶液Ⅰ、溶液Ⅱ和溶液Ⅲ的用量,吸附和洗脱时可以适当的延长时间,以增加提取效率。 DNA浓度及纯度检测:得到的质粒DNA纯度与样品保存时间、操作过程中的剪切力等因素有关。得到的DNA可用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测浓度与纯度。DNA应在OD260处有显著吸收峰,OD260值为1相当于大约50μg/ml双链DNA、40μg/ml单链DNA。OD260/OD280比值应为1.7~1.9,如果洗脱时不使用洗脱缓冲液,而使用去离子水,比值会偏低,因为pH值和离子存在会影响光吸收值,但并不表示纯度低。 操作步骤: 取1~5mL细菌培养物,12000rpm离心1min,尽量吸除上清(菌液较多时可以通过多次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中)。 向留有菌体沉淀的离心管中加入200μL溶液Ⅰ(请先检查是否已加入RNase A),使用移液器或旋涡振荡器彻底悬浮细菌细胞沉淀。再向其中加入50μL,混匀。37℃水浴30min以上(根据菌液量可适当加长水浴时间)。 注意:如果菌块未彻底混匀,会影响裂解导致质粒提取量和纯度偏低。如不能确定为何种菌,请按阳性菌处理。 向离心管中加入250μL溶液Ⅱ,温和地上下翻转6~8次使菌体充分裂解。 注意:混匀一定要温和,以免污染基因组DNA,此时菌液应变得清亮粘稠,作用时间不要过5min,以免质粒受到破坏。 向离心管中加入350μL溶液Ⅲ,立即温和地上下翻转6~8次,充分混匀,此时会出现白色絮状沉淀。12000rpm离心10min。 注意:溶液Ⅲ加入后应立即混匀,避免产生局部沉淀。如果上清中还有微小白色沉淀,可再次离心后取上清。 将上一步所得上清液加入吸附柱中(吸附柱加入收集管中),室温放置2min,12000rpm离心1min,倒掉收集管中的废液,将吸附柱重新放回收集管中(如果一次加不完,可分两次吸附)。 向吸附柱中加入600μL漂洗液(使用请先检查是否已加入无水乙醇),12000rpm离心1min,弃废液,将吸附柱放入收集管中。 向吸附柱中加入600μL漂洗液,12000rpm离心1min,弃废液,将吸附柱放入收集管中。 12000rpm离心2min,将吸附柱敞口置于室温或50℃温箱放置数分钟,目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除,否则漂洗液中的乙醇会影响后续实验如酶切、PCR等。 将吸附柱放入一个干净的离心管中,向吸附膜中央悬空滴加50~200μL经65℃水浴预热的洗脱液,室温放置2min,12000rpm离心1min,收集质粒DNA溶液。 (可选)为了增加质粒的回收率,可将得到的洗脱液重新加入吸附柱中,室温放置2min,12000rpm离心1min。 |
1.CTAB 溶液在低于15℃时会析出沉淀,因此在将其加入冷冻的植物材料中之必须预热。
2.在适条件下,DNA—CTAB 沉淀呈白色纤维状,很容易一下子就从溶液中钩出。不过,某些植物种的DNA 沉淀中可能含有杂质,特别是多糖,使DNA 沉淀呈絮状或胶状,这种情况下可能需要稍事离心才能得到DNA. —CTAB 沉淀。
3.饱和酚虽然可有效地使蛋白质变性,但酚不能完全抑制RNA 酶的活性,而且酚可以溶解含poLy(A)的mRNA。如果用*和的混合液,可减轻这两种现象,同时可加入适量的异戊醇(*—异戊醇=25:24:1),异戊醇的作用是消泡,并使蛋白质层紧密,使水相和有机相分层较好。 细菌的培养和收集 将含有质粒pBS 的DH5α菌种接种在LB 固体培养基(含50μg/ml Amp)中, 37℃培养12-24 小时。用无菌牙签挑取单菌落接种到5ml LB 液体培养基(含50μg/ml Amp)中,37℃振荡培养约12 小时至对数生长后期。小量提取法对于从大量转化子中制备少量部分纯化的质粒DNA 十分有用。这些方法共同特点是简便、快速,能同时处理大量试样,所得DNA 有一定纯度,可满足限制酶切割、电泳分析的需要。
唾液酸结合Ig样凝集素2(SIGLEC2)酶联免疫试剂盒2-溴-3-十二烷基噻吩 95%2,6-二氯苯肼盐酸盐 98%紫尿酸 一水合物(97%)
革兰氏阳性菌质粒小量提取试剂盒(1~5mL)Ketoconazole
注意事项:
1) 由于细胞凋亡是一个快速的过程,建议样品在染色后1小时之内进行分析。
2) 对于贴壁细胞,消化是一个关键步骤。贴壁细胞诱导细胞凋亡时如有漂浮细胞,需收集漂浮细胞和贴壁细胞后合并染色。处理贴壁细胞时要小心操作,尽量避免人为的损伤细胞。*消化时间过短,细胞需要用力吹打才能脱落,容易造成细胞膜的损伤,PI摄入过多;消化时间过长,细胞膜同样易造成损伤,甚至会
影响细胞膜上磷脂酰*与Annexin V-FITC的结合。消化时将*铺满孔板底后,轻摇时*与细胞充分接触,然后倒掉大部分*,利用剩余的少量*再消化一段时间,待细胞间空隙增大,瓶底呈花斑状即可终止。在消化液中尽量不用EDTA,EDTA会影响Annexin V与PS的结合。
3) 实验中如需要固定细胞,比如在检测凋亡的同时检测细胞周期,只能选用Annexin V-FITC,而不能选用Annexin V-EGFP,因为在固定过程中EGFP会变性导致丧失激发荧光的能力。固定需要先将细胞与Annexin V-FITC进行孵育,并用binding buffer洗掉未结合的Annexin V-FITC。因为固定过程中细胞通透性增加会产生细胞碎片,可以和Annexin V结合,对结果产生干扰。
4) 如果样品来源于血液,请务必除去血液中的血小板。因为血小板含有PS,能与Annexin V结合,从而干扰实验结果。可以使用含有EDTA的缓冲剂并在200 g离心洗去血小板。
5) 试剂在开盖请短暂离心,将盖内壁上的液体甩至管底,避免开盖时液体洒落。
6) Annexin V-FITC和PI是光敏物质,在操作时请注意避光。
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