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一步法质粒大提试剂盒(10~100mL)
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详细内容
1.根据要保存的各样本的体积,计算出所需RNAwait用量。RNAwait的用量应当是组织体积的10倍(如100mg组织约用1ml RNAwait);离心收集2×106细胞RNAwait的用量是1ml。
2. 将RNAwait按需要量分装入自备保存管中;
3. 快速将较大的组织切成厚度<0.5 cm的任意片状,立即完全浸入RNAwait中。组织的厚度一定要<0.5 cm。组织过厚则RNAwait不能有效渗入,组织中间部位的RNA不能受到保护。较小的组织(如大鼠的肾脏、脾脏,小鼠的大部分器官)取下后可以直接浸入RNAwait。
4. 保存时先将样本浸入RNAwait后置4℃冰箱过夜(4℃过夜是必需的,这样可使RNAwait完全渗入到组织中),然后转移到-20℃冰箱(RNAwait在-20℃时仍为液态,有结晶析出,是正常情况);或者在4℃冰箱过夜后,从RNAwait中取出组织块,转移到-80℃冰箱。在RNAwait中保存的标本,反复冻融至室温20次不影响RNA的质量。
产品属性:
中文名称:一步法质粒大提试剂盒(10~100mL)
英文名称:One-Step Plasmid Maxi Kit(10-100mL)
产品规格:5次
产品货号:GOY-F9733
| 试剂盒特点: 快速,整个质粒DNA提取过程只需要不到30分钟,比传统的碱变性方法快捷。 螺旋比例高,的非碱法一步式细菌裂解技术,避免了碱对DNA的损害,得到的质粒DNA切口更少。 DNA纯度高,几乎没有基因组DNA和RNA污染,OD260/280一般在1.7~1.9之间。 DNA可以直接用于电泳、酶切、PCR、细菌转化、分子克隆等实验。 大吸附量为600μg DNA,具体产率取决于质粒拷贝数。 过程简单,重复性和稳定性好。 保存条件: 常温运输及保存(溶液A需要4℃保存),有效期一年。 使用方法: 用50mL离心管分数次收集10~60mL新鲜的菌液,一般可以5000rpm 离心10分钟,去除上清即得细菌沉淀。 往细菌沉淀中加入14mL溶液A,充分振荡悬浮或吹打混匀。 注意:充分重悬细胞沉淀(无块状物)对于获得高的质粒产量十分重要。 将裂解液全部转移到大离心吸附柱中,放入到配套的收集管中。 6000rpm离心5~10分钟,弃穿透液。离心过滤柱将吸附溶液中的质粒DNA,而将基因组DNA和杂质在穿透液中。如果离心吸附柱中还有未离心下去的裂解液,可以适当延长离心时间直到离心吸附柱中没有残留液体。 将10mL通用预洗液加入到离心吸附柱中,室温静置2分钟后6000rpm离心5分钟,弃穿透液。 重复上步一次。 将10mL通用洗柱液加入到离心吸附柱中,室温静置2分钟后6000rpm离心5分钟,弃穿透液。 重复上步一次。 室温6000rpm空甩5分钟,弃穿透液。注意:此步很重要,不能跳过。 将离心吸附柱放入一个自备的、干净的50mL塑料离心管中,加1mL通用洗脱液(洗脱液如加热到50~65℃效果更佳),室温静置2分钟后6000rpm离心5分钟,收集液即是质粒DNA溶液。 重复上步1次以便洗脱更多的质粒DNA。 合并所得质粒DNA,立即使用或-20℃储存。 |
1.CTAB 溶液在低于15℃时会析出沉淀,因此在将其加入冷冻的植物材料中之必须预热。
2.在适条件下,DNA—CTAB 沉淀呈白色纤维状,很容易一下子就从溶液中钩出。不过,某些植物种的DNA 沉淀中可能含有杂质,特别是多糖,使DNA 沉淀呈絮状或胶状,这种情况下可能需要稍事离心才能得到DNA. —CTAB 沉淀。
3.饱和酚虽然可有效地使蛋白质变性,但酚不能完全抑制RNA 酶的活性,而且酚可以溶解含poLy(A)的mRNA。如果用*和的混合液,可减轻这两种现象,同时可加入适量的异戊醇(*—异戊醇=25:24:1),异戊醇的作用是消泡,并使蛋白质层紧密,使水相和有机相分层较好。 细菌的培养和收集 将含有质粒pBS 的DH5α菌种接种在LB 固体培养基(含50μg/ml Amp)中, 37℃培养12-24 小时。用无菌牙签挑取单菌落接种到5ml LB 液体培养基(含50μg/ml Amp)中,37℃振荡培养约12 小时至对数生长后期。小量提取法对于从大量转化子中制备少量部分纯化的质粒DNA 十分有用。这些方法共同特点是简便、快速,能同时处理大量试样,所得DNA 有一定纯度,可满足限制酶切割、电泳分析的需要。
血小板膜糖蛋白Ⅱb/Ⅲa(GPⅡbⅢa)酶联免疫试剂盒钙镁试剂 Indicator环丁酮 99%乙基环己烷(标准品)
一步法质粒大提试剂盒(10~100mL)1-Chloroethyl cyclohexyl carbonate
注意事项:
1) 由于细胞凋亡是一个快速的过程,建议样品在染色后1小时之内进行分析。
2) 对于贴壁细胞,消化是一个关键步骤。贴壁细胞诱导细胞凋亡时如有漂浮细胞,需收集漂浮细胞和贴壁细胞后合并染色。处理贴壁细胞时要小心操作,尽量避免人为的损伤细胞。*消化时间过短,细胞需要用力吹打才能脱落,容易造成细胞膜的损伤,PI摄入过多;消化时间过长,细胞膜同样易造成损伤,甚至会
影响细胞膜上磷脂酰*与Annexin V-FITC的结合。消化时将*铺满孔板底后,轻摇时*与细胞充分接触,然后倒掉大部分*,利用剩余的少量*再消化一段时间,待细胞间空隙增大,瓶底呈花斑状即可终止。在消化液中尽量不用EDTA,EDTA会影响Annexin V与PS的结合。
3) 实验中如需要固定细胞,比如在检测凋亡的同时检测细胞周期,只能选用Annexin V-FITC,而不能选用Annexin V-EGFP,因为在固定过程中EGFP会变性导致丧失激发荧光的能力。固定需要先将细胞与Annexin V-FITC进行孵育,并用binding buffer洗掉未结合的Annexin V-FITC。因为固定过程中细胞通透性增加会产生细胞碎片,可以和Annexin V结合,对结果产生干扰。
4) 如果样品来源于血液,请务必除去血液中的血小板。因为血小板含有PS,能与Annexin V结合,从而干扰实验结果。可以使用含有EDTA的缓冲剂并在200 g离心洗去血小板。
5) 试剂在开盖请短暂离心,将盖内壁上的液体甩至管底,避免开盖时液体洒落。
6) Annexin V-FITC和PI是光敏物质,在操作时请注意避光。
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