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无内毒素质粒大提试剂盒(100~300mL)
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详细内容
低温非冻型保存,不破坏病毒的外壳,方便长途运输。
适用于各种拭子样品,包括口腔拭子、鼻腔拭子、咽喉拭子、阴道拭子等。
可以用于H1N1流感病毒和其他任何可以用拭子取样的病毒。
可以用柱式病毒DNA提取试剂盒或柱式病毒RNA提取试剂盒提取病毒核酸。
试剂本身安全环保无毒。
储存条件:常温,有效期一年。
下列是产品的订购信息!
| 中文名称 | 英文名称 | 产品规格 | 货号 |
| 无内毒素质粒大提试剂盒(100~300mL) | GoldHigh Endo-Free Plasmid Maxi Kit(100~300 ml) | 2次|10次 | GOY-F9718 |
产品说明书:
| 本试剂盒提供一种简单快捷高效提取无内毒素质粒的新方法,在碱裂解法裂解细胞的基础上,采用独特的硅基质膜吸附技术,高效一的结合质粒DNA;同时采用特殊的缓冲液系统和去内毒素buffer,有效去除内毒素、基因组DNA、RNA、蛋白等杂质。每次可处理100~300mL菌液,获得多至2mg转染质粒DNA,整个提取过程只需50分钟。本试剂盒所得质粒纯度高、提取量大,特别适用于细胞转染,同时也可用于DNA测序,PCR,体外转录,内切酶消化等实验。 内毒素是质粒提取中常见的污染物,由于真核细胞对内毒素非常敏感,因此,如果质粒中含有内毒素会大大降低真核细胞转染效率。 保存:室温(15~30℃) 自备试剂: 无水乙醇、异丙醇。 实验准备及重要注意事项: 所有组分可在干燥、室温(15~30℃)环境稳定保存1年,将吸附柱置于2~8℃可保存更长时间,加入RNase A的Buffer P1置于2~8℃可稳定保存6个月。 Buffer P1在使用先加入RNase A(将试剂盒中提供的RNase A全部加入),混匀,置于2~8℃保存。使用需在室温中放置一段时间,恢复至室温后使用。 第yi次使用应按照试剂瓶标签的说明在Buffer PW中加入无水乙醇。 使用请先检查Buffer P2和Buffer E3是否出现结晶或沉淀,如有结晶或沉淀现象,可在37℃水浴几分钟,即可恢复澄清。 注意Buffer P2和Buffer E3含有刺激性物质,请戴手套操作,使用后应立即盖紧盖子。 使用Buffer PS处理过的吸附柱好立即使用,避免放置时间过长影响使用效果。 提取质粒的量和纯度与细菌培养浓度、菌株种类、质粒大小、质粒拷贝数等因素有关。 操作步骤: 取150mL过夜培养的菌液,加入离心管(自备)中,12000×g离心2~3分钟收集细菌,尽量吸弃全部上清。 向留有菌体沉淀的离心管中加入12mL Buffer P1(请先检查是否已加入RNase A) 使用移液器或涡旋振荡器充分混匀,悬浮细菌沉淀。 注意:如果菌块未彻底混匀,将会影响裂解效果,使提取量和纯度偏低。 向离心管中加入12mL Buffer P2,温和地上下颠倒混匀8~10次,使菌体充分裂解,室温放置3~5分钟。此时溶液应变得清亮粘稠。 注意:温和混匀,不要剧烈震荡,以免打断基因组DNA,造成提取的质粒中混有基因组DNA段片。如果溶液未变得清亮,提示可能菌量过大,裂解不彻底,应减少菌体量。 向离心管中加入12mL Buffer E3,立即上下颠倒混匀8~10次,此时出现白色絮状沉淀,室温放置5分钟。12000×g离心10分钟,将上清转移至干净离心管(自备)中,注意不要带入沉淀。 注意:Buffer E3加入后应立即混匀,避免产生局部沉淀。 加入0.3倍滤液体积的异丙醇,上下颠倒混匀。 注意:加入异丙醇过多容易导致RNA污染。 柱平衡:向已装入收集管中的吸附柱DQ中加入2mL Buffer PS,12000×g离心2分钟,倒掉收集管中的废液,将吸附柱重新放回收集管中。 将步骤5中液体与异丙醇的混合溶液转移到平衡好的吸附柱DQ(已装入收集管)中。12000×g离心2分钟,倒掉收集管中的废液,将吸附柱重新放回收集管中。 注意:吸附柱的大容积为15mL,所以第7步中所得溶液分多次过柱。如果离心机转子倾角较大时,建议加入吸附柱的溶液体积不过10mL,以防发生漏液现象。 向吸附柱中加入10mL Buffer PW(请先检查是否已加入无水乙醇),12000×g离心2分钟,倒掉收集管中的废液。 重复步骤8。 向吸附柱中加入10mL Endo-Free Buffer PW,12000×g离心2分钟,倒掉收集管中的废液,将吸附柱重新放回收集管中。 将吸附柱重新放回收集管中,12000×g离心5分钟,倒掉废液,将吸附柱置于室温数分钟,以彻底晾干吸附柱中残余的漂洗液。 注意:这一步的目的是将吸附柱中残余的乙醇去除,乙醇的残留会影响后续的酶促反应(酶切、PCR等)。 将吸附柱置于一个新的离心管中,向吸附膜的中间部位加入1~3mL Endo-Free Buffer EB,室温放置2~5分钟,12000×g离心5分钟,将质粒溶液收集到离心管中。-20℃保存质粒。 注意: 1)为了增加质粒的回收效率,可将得到的溶液重新加入到吸附柱中,室温放置2~5分钟,12000×g离心5分钟,将质粒溶液收集到离心管中。 2)质粒拷贝数较低或>10kb时,Endo-Free Buffer EB在65~70℃水浴预热,可以增加提取效率。 |
注意:标本采集人员需按有关规定做好个人防护。咽、鼻拭子好在发病的3天采集。
在安全柜内将本产品分装到自备的、螺旋盖内有橡胶圈的5mL旋盖塑料管里(一容器)。
鼻拭子的采集:将棉签轻轻插入鼻道内鼻腭处,停留片刻后缓慢转动退出。以同一拭子拭两侧鼻孔。将棉签浸入上步得到的、装有3mL本产品的旋盖离心管中,弃去拭子尾部,拧紧螺旋盖。
咽拭子的采集:用棉签擦拭双侧咽扁桃体及咽后壁,将棉签浸入步得到的、装有3mL本产品的旋盖离心管中,弃去拭子尾部,拧紧螺旋盖。
直接在一容器上用油性记号笔写明样本的种类、采样时间、编号、患者姓名。
将密闭后的标本放入大小适合的塑料袋内密封;每袋装一份标本。同时也将标本有关信息填在标本送检表上,连同一容器封于塑料袋内。
将装标本的密封袋放入自备的带螺旋盖内有橡胶圈的塑料容器(二容器)内,拧紧盖,在容器上标明有关信息。同一患者2份以上的密封标本,可以放在同一个二容器内。二容器要承受不少于95 KPa的压力,内衬具吸水和缓冲能力的物质。所有容器必须印有生物危险标注。
将二容器摆放在用运输箱内(或疫苗运输箱),放入冰排,然后以柔软物质填充,并密封,由人(2人)运送,不得邮寄,好使用车。
采集的标本若不能在24小时内送达,则应尽快在⁻⁷0℃以下保存。无⁻⁷0℃条件的,需在4℃冰箱短时间暂存,并尽快联系递送标本。流感病毒在-20℃~-40℃时不稳定,故长期保存好在⁻⁷0℃温度以下进行。
操作程序:
注意:重要的是及时固定,并在固定液中加入0.1%的DEPC处理,以抑制RNA酶对mRNA的分解作用。此外,过度固定对原位杂交有明显的不利影响。
1.玻片的处理:一般采用多聚赖氨酸或APES。切片厚度10-20μm。
2.细胞在多聚赖氨酸处理的盖玻片上进行培养,条件为37℃和5%的CO2,所用培养基为Dulbecco基础培养基。细胞长好后0.1M PBS(PH7.4)洗2分钟×3次。
3.培养细胞和冰冻切片均可用下述方法固定:固定液为4%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.2⁻⁷.6),含有1/1000 DEPC。室温固定 20--30分钟。蒸馏水充分洗涤,干燥后-20℃冰冻可保存2周以上。
4.30%H2O2 1份+纯甲醇50份混合,室温处理30分钟。蒸馏水洗涤3次。
5.暴露mRNA核酸片段:切片上滴加3%柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶(1ml 3% 柠檬酸加2滴浓缩型胃蛋白酶,混匀),37℃或室温消化5—120钟。有时也可以不消化。原位杂交用 PBS洗3次×5分钟。蒸馏水洗1次。
6.后固定:胃蛋白酶消化后才需要。固定液为1%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.2⁻⁷.6),含有1/1000 DEPC。室温固定 10分钟。蒸馏水洗涤3次。
7.预杂交:湿盒的准备——干的杂交盒底部加20%甘油20ml以保持湿度。按每张切片20μι加预杂交液。恒温箱38-42℃2—4小时。吸取多余液体,不洗。
8.杂交——按每张切片20μι杂交液,加在切片上。将原位杂交用盖玻片的保护膜揭开后,盖在切片上。恒温箱38-42℃杂交过夜(根据杂交情况可以调节)。
9.杂交后洗涤:揭掉盖玻片,37℃左右水温的2×SSC洗涤5分钟×2次;37℃0.5×SSC洗涤15分钟×1次; 37℃0.2×SSC洗涤15分钟×1次(如果有非特异性染色,重复0.2×SSC洗涤15分钟×1-2次)。
10.滴加封闭液:37℃30分钟。甩去多余液体,不洗
11.滴加生物素化鼠抗*:37℃ 60分钟或室温120分钟。原位杂交用PBS洗5分钟×4次。勿用其它缓冲液和蒸馏水洗涤。
12.滴加SABC:37℃20分钟或室温30分钟。原位杂交用PBS洗5分钟×3次。勿用其它缓冲液和蒸馏水洗涤。
13.滴加生物素化过氧化物酶:37℃20分钟或室温30分钟。原位杂交用PBS洗5分钟×4次。
14.DAB显色:使用DAB显色试剂盒—1ml蒸馏水加显色剂A,B,C各一滴,混匀,加至标本上。一般显色20-30分钟。若无背景出现则可继续显色。也可自配DAB显色剂后显色。充分水洗。
15.必要时苏木素复染,充分水洗。
16.酒精脱水,二甲苯透明,封片。
载脂蛋白L2(APOL2)酶联免疫试剂盒1-正丁基-1-甲基吡咯烷二(三氟甲基磺酰)酰亚 98%N,N-二乙基乙二 98%二十四烷酸甲酯(标准品)
无内毒素质粒大提试剂盒(100~300mL)(1S,2R)-2-Amino-1,2-diphenylethanol
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