柱分离质粒提取，离心后上清浑浊，沉淀无法粘附在管底

这是质粒提取中最常见的故障之一，核心本质是细胞裂解 / 中和不、沉淀组分异常或离心参数不当，导致基因组 DNA、蛋白、脂质等杂质无法形成致密沉淀，大量悬浮在上清中。预染 Marker 正常已排除电泳和转膜基础问题，以下按可能性从高到低排序，附排查和解决方法：

一、头号原因：菌体过量（占比约 50%）

这是绝大多数新手和高通量提取时出现该问题的根源。

核心机制：试剂盒的裂解液 / 中和液量是固定的，仅能处理一定量的菌体。当菌体过量时：

裂解不充分，大量未破裂的细胞形成松散沉淀

基因组 DNA 释放过多，中和后形成网状絮状沉淀，无法被离心压实

蛋白、脂质等杂质过载，沉淀密度降低，容易漂浮

典型特征：

沉淀呈白色絮状、蓬松状，轻轻晃动管子就会散开

上清呈乳白色浑浊，甚至能看到悬浮的细丝状物质

后续上柱时流速极慢，甚至完全堵塞柱子

解决方案：

严格控制菌体量：常规小提试剂盒（50μg 容量）仅能处理1-5mL OD600=0.6-1.0 的菌液，高拷贝质粒不超过 3mL，低拷贝质粒不超过 5mL

若菌液过浓（OD600>1.5），按比例减少上样量，或用 LB 培养基稀释后再离心收集

已经出现浑浊的上清：可在 4℃下 12000rpm 再次离心 10 分钟，小心吸取上层澄清部分上柱，避免触及沉淀

二、裂解与中和操作不当（占比约 30%）

1. 裂解时间过长或混匀过于剧烈

核心机制：

裂解时间 > 5 分钟：NaOH 会断裂基因组 DNA 成小片段，这些小片段无法在中和步骤形成沉淀，会混入上清导致浑浊

剧烈涡旋混匀：会剪切基因组 DNA，同样产生大量可溶的小片段 DNA

典型特征：上清呈半透明浑浊，有大量细小悬浮颗粒，沉淀呈松散的棉絮状

解决方案：

严格控制裂解时间：加入裂解液后轻轻颠倒混匀 4-6 次，室温放置不超过 5 分钟，直到溶液变得清亮粘稠

绝对禁止涡旋振荡裂解液，只能缓慢颠倒混匀

若溶液出现拉丝现象（基因组 DNA 释放过多），立即加入中和液终止裂解

2. 中和不充分或混匀方式错误

核心机制：中和液（醋酸钾）未与裂解液充分混合，导致局部 pH 过高，蛋白和基因组 DNA 无法完全沉淀。

典型特征：

溶液中存在明显的团块状白色沉淀，分布不均匀

上清呈分层状，上层澄清，下层浑浊

离心后沉淀集中在管子一侧，另一侧上清浑浊

解决方案：

加入中和液后立即剧烈颠倒混匀 10-15 次，确保溶液完全混合，无局部白色团块

冰上放置 5-10 分钟，让沉淀充分形成（这一步很多人会省略，是关键）

若仍有未溶解的白色团块，可再颠倒混匀几次，不要用枪头吹打

3. 菌体重悬不

核心机制：收集菌体后未完全重悬，存在菌体团块，导致内部细胞无法被裂解，离心后形成松散的菌块沉淀。

典型特征：沉淀呈颗粒状，有明显的未裂解菌体团块，上清浑浊但无拉丝现象

解决方案：

加入重悬液后，用枪头充分吹打菌体沉淀，直至完全分散，无可见团块

若菌体沉淀较紧，可先涡旋振荡 10 秒，再用枪头吹打

三、离心参数错误（占比约 10%）

1. 离心速度不足或时间过短

核心机制：离心力不够，无法将低密度的蛋白 - DNA 复合物沉淀压实，导致沉淀漂浮在上清中。

典型特征：沉淀呈薄薄的一层贴在管壁，或呈云雾状悬浮在液体中，轻轻晃动就会散开

解决方案：

严格按照试剂盒说明书设置离心参数：常规为12000-14000rpm，4℃离心 10-15 分钟

若室温离心，需将离心时间延长至 15-20 分钟

已经离心过的样品，可再次 14000rpm 4℃离心 10 分钟

2. 离心温度过高

核心机制：室温过高会降低沉淀的密度，同时使 SDS - 蛋白复合物的溶解度增加，导致沉淀不完全。

典型特征：夏天室温 > 30℃时频繁出现，沉淀量明显减少，上清浑浊

解决方案：

所有离心步骤均在 4℃下进行

裂解和中和步骤也尽量在冰上操作

若没有冷冻离心机，可将离心管放在冰上预冷后再离心

四、试剂问题（占比约 7%）

1. 裂解液失效

核心机制：

SDS 在低温下会析出沉淀，导致裂解能力下降

NaOH 吸收空气中的 CO2，浓度降低，无法有效裂解细胞

典型特征：加入裂解液后溶液不变清亮，仍呈浑浊的菌液状态

解决方案：

检查裂解液是否有白色沉淀，若有，可在 37℃水浴中加热溶解后使用

裂解液开封后超过 3 个月建议更换

确保 NaOH 溶液是新鲜配制的

2. RNase A 失效或未添加

核心机制：RNase A 失效会导致大量 RNA 未被降解，RNA 会与蛋白、基因组 DNA 形成复合物，使沉淀变得松散，同时上清因含有大量 RNA 而浑浊。

典型特征：沉淀呈粘稠的胶状，上清浑浊且有明显的粘稠感，后续电泳会出现大量 RNA 条带

解决方案：

重悬液中必须按比例加入 RNase A，且 RNase A 需 - 20℃保存

若怀疑 RNase A 失效，可在重悬液中额外加入 1μL 10mg/mL 的 RNase A

已经提取的质粒，可在洗脱后加入 RNase A 37℃孵育 30 分钟

3. 中和液配制错误

核心机制：醋酸钾浓度过低或 pH 错误，无法有效中和 NaOH，也无法使 SDS 和蛋白沉淀。

典型特征：加入中和液后无白色沉淀生成，溶液仍呈清亮状态

解决方案：重新配制中和液（标准配方：3M 醋酸钾，pH5.5）

五、罕见但易被忽略的原因（占比约 3%）

使用了低吸附离心管：低吸附离心管的表面经过疏水处理，会导致蛋白沉淀无法粘附在管底，容易漂浮。应使用普通聚丙烯离心管。

离心管不平衡：离心时管子不平衡会导致离心力分布不均，沉淀无法集中在管底，呈分散状。

菌体老化或死亡：培养时间过长（>16 小时）的菌体，细胞壁增厚，难以裂解，且会释放大量胞内酶，降解质粒和蛋白。应使用对数生长期的菌液（培养 12-14 小时）。

抗生素浓度过低：导致杂菌污染，杂菌的裂解产物会增加沉淀的复杂性，使上清浑浊。

紧急补救与快速排查步骤

紧急补救：将浑浊的上清转移到新的离心管中，4℃ 14000rpm 再次离心 15 分钟，用宽口枪头小心吸取最上层 1/2-2/3 的澄清液体上柱，绝对不要触及沉淀。

快速排查：

步：减少菌体量至原来的 1/2，重新提取，若问题解决→菌体过量

第二步：严格控制裂解时间 < 5 分钟，温和混匀，若问题解决→裂解操作不当

第三步：4℃离心 15 分钟，若问题解决→离心参数错误

第四步：更换新的试剂盒试剂，若问题解决→试剂失效