做 ELISA 实验时，如何分离血浆？

采血后要尽快处理，避免纤维蛋白原析出、抗原降解，全程尽量低温操作，防止后续 ELISA 出现高背景、孔间 CV 偏大。

采血完成后轻轻颠倒采血管混匀 5 到 8 次，动作轻柔，不要剧烈震荡，剧烈震荡会造成溶血，血红蛋白会干扰 ELISA 信号、加重基质干扰。混匀后静置，不要放室温长时间等待，尽快转入离心机。

离心条件推荐 4℃，3000g，离心 10 到 15 分钟。如果离心机达不到 4℃，室温离心也可以，但分离完成后血浆要立刻转移冰上保存，并且尽量缩短样本放置时间。离心结束后，管内会明显分成上层血浆、下层血细胞沉淀，中间薄层白膜。吸取血浆时枪头不要触碰白膜和底部红细胞沉淀，避免吸到血细胞碎片，一旦带入红细胞，溶血产物会升高背景。

吸出上层血浆转移至新离心管。如果后续要做 ELISA，建议增加一步二次离心，取初分离的血浆，4℃，10000g 离心 5 分钟，小心吸取上清。这一步可以去除微量纤维蛋白沉淀、血小板碎屑，很大程度减少微孔板中非特异吸附，尤其适合反复冻融样本或者容易出现高背景、异嗜干扰的实验。

分装血浆，按单次实验用量分成小体积，避免后续反复冻融。短期放置 2 到 8℃，尽量在 24 小时内上机；长期保存直接放 - 80℃，不建议 - 20℃长期存放，冰晶会促进纤维蛋白析出，增加干扰。

需要避开的关键点。不要静置太久再离心，放置时间过长会出现纤维蛋白析出，产生絮状物，一旦絮状物进入酶标板，会随机吸附造成孔与孔之间差异。严禁剧烈摇晃，溶血是血浆 ELISA 最常见的干扰源。吸取血浆不要吸到白膜层，白膜含有大量血小板、白细胞，破裂后释放蛋白酶，降解抗原，同时增加非特异吸附。

不同抗凝采血管的小差别。枸橼酸钠采血管，一定要严格遵守 9 份血液加 1 份抗凝剂的比例，采血不足会导致抗凝剂相对浓度偏高，带来基质干扰，后续结果需要做稀释校正。EDTA 采血管，干粉型采血管采血后充分颠倒混匀即可，不需要额外校正。肝素管尽量不用于 ELISA，如果不得已使用，分离后必须二次离心，且要做基质回收验证。

如果样本已经出现肉眼可见的纤维絮状物，不建议直接上机，可再次高速离心取上清，絮状物过多的样本建议直接舍弃，会造成 ELISA 背景异常、结果不稳定。

论文方法描述参考。全血采集至抗凝采血管，轻柔颠倒混匀，4℃条件下 3000g 离心 15 min，小心吸取上层血浆。血浆样本经二次 4℃10000g 离心 5 min，收集上清分装，用于 ELISA 检测。样本短期置于 2~8℃保存，长期保存于 - 80℃。