肪间充质干细胞（Adipose-derivedMesenchymalStemCells,ADSCs）是来源于脂肪组织的干细胞，与其它成体干细胞一样具有自我更新和多向分化的能力。人和鼠的脂肪组织均可用于分离ADSCs，其中鼠脂肪组织通常取自腹股沟处脂肪垫。听说你们都想偷师ADSCs原代取材，那就来安排！

材料准备

大鼠脂肪间充质干细胞培养基

胰蛋白酶细胞消化液（0.25%）
0.1%I型胶原酶溶液

实验步骤

1、10天龄到4周龄大鼠1只，麻醉处死，75%乙醇浸泡消毒3~5min。无菌条件下切开腹股沟皮肤，暴露腹股沟脂肪垫。

2、钝性剥离脂肪组织，清洗并去除筋膜组织及小血管。将脂肪垫剪碎，转移至15mL离心管中。

3、加入3~4倍体积的0.1%I型胶原酶溶液，37℃水浴振荡约20min，直至细胞混合物成乳状浓稠液体。期间可吹打脂肪组织，辅助消化。

4、250×g，4℃，离心5min。注意离心机预冷至4℃。

5、小心吸去上层油脂，注意不要破坏位于下方的胶状沉淀。加人5mL培养基,重悬沉淀，转移到新的离心管中，再次离心5min。

6、重复洗涤一次，吸去上清。

7、加入8mL培养基重悬沉淀，转移至T25培养瓶中，置于37℃,5%CO2温箱中。

8、待细胞贴壁生长48h后观察、换液。

9、换液时通过弃去培养基，从而去除未贴壁的细胞。

10、以后每两天更换一次培养基，细胞汇合达80%-90%时，0.25%胰蛋白酶消化，按1:2或1:3比例传代。

注意事项

取材时应将组织清洗干净，仔细剥离去除血管和筋膜组织

脂肪组织在剪碎的过程中不能研磨，以免破坏细胞

消化完后的组织在离心把离心机预冷，使细胞更好的与油脂分离

用明胶或者胶原蛋白处理培养皿底壁，有利于细胞的贴壁生长

鉴定

1、形态学观察：原代培养后，传代2-3次，ADSCs呈现单层，梭状或多枝状的细胞形态，其直径在25-30um，待细胞达到汇合时，它们形态上呈纺锤形，类似于成纤维细胞，贴壁较牢固。

2、微生物：常使用培养法和PCR法检测细菌、真菌、支原体。

3、增殖：CCK8生长曲线，计算倍增时间。

4、标记物检测：一般的标准为CD29、CD44、CD73、CD105为阳性（>70%）；CD34、CD45、CD11b为阴性（<5%）。

5、诱导分化实验：在特定的诱导条件下，脂肪间充质干细胞可以分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、神经细胞、上皮细胞、心肌细胞等多种细胞。