分光光度法50管/48样

注意：正式测定之选择2-3个预期差异大的样本做预测定。

测定意义：

超氧阴离子自由基作为生物体代谢过程中产生的一种自由基，可攻击生物大分子，如脂质、蛋白质、核酸和聚不饱和脂肪酸等，使其交链或者断裂，引起细胞结构和功能的破坏，与机体衰老和病变有很密切的关系，清除超氧阴离子自由基的研究已经得到了广泛的关注。

测定原理：

AP-TEMED系统产生超氧阴离子，与盐酸羟胺反应生成NO₂^－，NO₂^－与对氨基苯磺酸和α－萘胺的作用生成红色的偶氮化合物，在530nm处有特征吸收峰，样品对超氧阴离子的清除能力与530nm的吸光值呈负相关。

自备实验用品及仪器：

天平、研钵、低温离心机、可见分光光度计、1 mL玻璃比色皿、恒温水浴锅。

试剂组成和配制：

提取液：液体50mL×1瓶，4℃保存。

试剂一：液体3mL×1瓶，4℃避光保存。

试剂二：粉剂×1瓶，4℃避光保存。临用加12mL蒸馏水充分溶解。

试剂三：液体15mL×1瓶，4℃保存。

试剂四：液体15mL×1瓶，4℃避光保存。

试剂五：液体15mL×1瓶，4℃避光保存。

样品处理：

1. 组织：按照质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g，加入1mL提取液）加入提取液，冰浴匀浆后于4℃，10000g离心10min，取上清置于冰上待测。

2. 细胞：按照细胞数量（10⁴个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细胞加入1mL提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3，间隔7，总时间3min）；然后4℃，10000g离心10min，取上清置于冰上待测。

3. 培养液或其它液体：直接检测。

4. 粉剂药物可配制成相同浓度，比如1mg/mL。

测定操作：

注意：对照管只需测定一次。

计算公式：

超氧阴离子清除率I%=

注意事项：

试剂一4℃可保存2个月，配制好的试剂二4℃可保存一周，建议实验配制，并尽快使用。

1. 样品处理完后立即进行测定，或者低温保存不超过24小时。