细胞名称：人永生化角质形成细胞Hacat/(STR鉴定正确)

　　该细胞源自一位62岁患有黑色素瘤男性的病灶外正常皮肤，角蛋白、角化细胞交联外膜蛋白、中间丝相关蛋白阳性。

　　细胞特性

　　1）来源：正常表皮组织

　　2）形态：上皮细胞样，贴壁生长

　　3）含量：>1x106细胞数

　　4）规格：T25瓶或者1mL冻存管包装

　　5)用途：仅供科研使用。

　　二．细胞的培养

　　培养基及培养冻存条件准备

　　1）准备DMEM培养基；胎牛血清，10%；双抗，1%。

　　2）培养条件：气相：空气，95%；二氧化碳，5%。温度：37摄氏度，培养箱湿度为70%-80%。

　　3）冻存液：90%血清，10%DMSO，现用现配。

　　细胞处理：

　　1）冻存细胞的复苏：

　　将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入到含4-6mL培养基的离心管中混合均匀。在1000RPM条件下离心3-5min，弃去上清液，培养基重悬细胞。然后将细胞悬液加入含6-8ml培养基的培养瓶（或皿）中37℃培养过夜。第二天显微镜下观察细胞生长情况和细胞密度。

　　2）细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

　　对于贴壁细胞传代可以参考以下方法：

　　1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

　　2.加入0.25％（w/v）胰蛋白酶-0.53mMEDTA于培养瓶中（T25瓶1-2mL，T75瓶2-3mL），置于37℃培养箱中消化1-2分钟（难消化的细胞可以适当延长消化时间），然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加入3-4ml含10%FBS的培养基来终止消化。

　　3.轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心3-5min，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。将细胞悬液按1：2的比例分到新T25瓶中，添加6-8ml按照说明书要求配置的新的培养基以保持细胞的生长活力，后续传代根据实际情况按1:2~1:5的比例进行。

　　3）细胞冻存:收到细胞后建议在培养3代时冻存一批细胞种子以备后续实验使用。

　　下面T25瓶为例；

　　1.细胞冻存时按照细胞传代的过程收集消化好的细胞到离心管中，可使用血球计数板计数，来决定细胞的冻存密度。一般细胞的推荐冻存密度为1×106~1×107个活细胞/ml.

　　2.1000rpm离心3-5min，去掉上清。用配制好的细胞冻存液重悬细胞，按每1ml冻存液含1×106~1×107个活细胞/ml分配到一个冻存管中将细胞分配到冻存管中，标注好名称、代数、日期等信息。

　　3.将要冻存的细胞置于程序降温盒中，-80度冰箱中过夜，之后转入液氮容器中储存。同时记录好冻存管在液氮容器中的位置以便后续查阅和使用。