大炮打蚊子？荧光寿命成像显微术用于IF自免荧光定量分析

广义的免疫组化以酶、荧光素、生物素、重金属离子等为示踪剂，通过抗原-抗体特异性结合，在组织切片或细胞薄片上原位显示细胞内的蛋白及组织结构，可对靶蛋白进行定位、定性和定量。按照主要示踪原理可以分为免疫酶标法、免疫荧光法和免疫胶体金技术。

在免疫荧光实验中，为什么大佬们的文章四色以上都可以结构清晰、定位准确，而我们的做个双色就会杂信号比靶信号还强呢？很大原因是组织自发的荧光没有处理好，造成信噪比降低，被误认为阳性表达、细胞共定位或者掩盖弱阳性信号。

内源生物分子自发荧光是免疫荧光显微检测的一大难题，研究人员已经开发出多种技术来抑制其发光，比如化学淬灭法、光漂白法、数字图像处理等。2025年哈佛医学院的研究团队在Scientific Reports发表一项研究，利用自发荧光与免疫荧光之间的寿命差异实现信号分离，建立高速的荧光寿命成像显微技术（FLIM），为高自发荧光组织的研究提供了新策略。

一、切片为什么会自发荧光？

自发荧光（Autofluorescence, AF）是指样本在荧光检测过程中、在不加入外源荧光染料的情况下，受特定波长激发后产生的非特异性背景荧光信号。自发荧光一般在355nm-488nm范围内被激发，对实验的呈现、拍照视野的选择、实验结果分析等有影响。其来源主要为组织内源性成分和样本处理诱导的荧光。

在组织或细胞内存在多种会发光的生物分子（如荧光蛋白、发光酶等）。荧光蛋白是一类广泛存在于自然界的蛋白质，吸收外界光能激发某种特定波长的荧光，可用于细胞标记和研究细胞内的生物过程。除此之外，还有NAD(P)H、脂褐素、网状纤维、胶原纤维、核黄素、胶原蛋白和弹性蛋白等，在可见光谱绿色和黄色波长范围内均可产生荧光。免疫荧光实验常用的染料是绿色波长通道的荧光素和Alexa Fluor 488，所以这些内源组分或影响实验结果的信噪比。

哺乳动物细胞中的自发荧光物质（源自文献：DOI: 10.1002/cyto.a.23199）

胶原纤维和弹性蛋白容易使纤维组织、血管壁、气道壁、基底膜样结构呈现连续或束状荧光，肺、皮肤、血管及纤维化组织中的干扰较明显。NADH是多种新陈代谢必需的酶，在代谢活跃的细胞和组织中含量高，例如肝脏和肾脏。脂褐素是一种颗粒状的亲脂性色素，随着年龄增长会在骨骼肌、神经元、心脏等组织中聚集，在500-695nm处发光。

除了样本自身的原因，还有一些人为因素会造成自发荧光。我们在实验中常用的固定剂是化学交联剂，会与组织中的氨基发生反应形成具有荧光特性的化合物（席夫碱），在蓝色、绿色和红色光谱范围内均可检测到信号。FFPE组织经过长时间固定、脱水和包埋后，常出现以蓝绿光激发更为明显的弥漫性背景。此外，石蜡切片中的黄素类、卟啉类化合物也会成为自发荧光的一份子。

二、如何确定是自发荧光呢？

设置未染色对照是识别自发荧光的常用方法，相邻的切片经过相同的固定、脱蜡、修复等过程，但对照组不加入一抗、二抗。如果对照出现与实验组相同的组织结构或颗粒，说明荧光信号主要来自组织或样本处理。

三、如何选择处理方法？

自发荧光属于杂信号，会对我们的检测结果造成干扰或误判，需要去除这些背景荧光。相对来说，冰冻切片自发荧光现象会比石蜡切片弱些。醛类固定的切片可经Sodium borohydride处理。非必要，固定剂不要选用乙二醛。心脏、肝脏、脾脏等组织含有大量红细胞，我们可以在固定前用PBS灌注组织。用低pH的CuSO4和NH4Cl处理或直接用H₂0₂漂白组织可实现自主消除。苏丹黑B能有效结合富含脂质的脂褐素颗粒而掩盖其自发荧光。

使用化学淬灭和光漂白有效但也会引入新的背景，如苏丹黑B会在远红光通道中发出荧光。苏丹黑B、台盼蓝、滂胺天蓝等会削弱抗体偶联染料的靶信号。没有一种淬灭剂适用于所有组织和染料。市面上还有一些自发荧光消除试剂盒。

还有用高功率LED灯或紫外灯通过光漂白降低组织自发荧光，如照射肾脏、肝脏、胰腺切片，操作相对简单，但难完全去除背景，也可能影响样本完整性或染色亮度。

几种方法的不足：

四、不消除自发荧光也能分离靶信号

既然常规方法存在这样那样的不足，那就另辟蹊径，尝试新的解决思路！

2025年，哈佛医学院的Wonsang Hwang等人建立了一种通过荧光寿命成像显微术（FLIM）成像分离自发荧光的新方法。研究团队通过与IHC结果进行比对验证其有效性，在不同组织样本集不同抗体-荧光团组合确认其稳定性。为突破传统FILM数据采集的速度限制，本文采用了模拟平均延迟法（AMD）的高速FILM方法，实现实时成像。

FLIM的原理是通过检测荧光分子激发态存续时长，分析分子微环境、蛋白相互作用与构象的变化，具有不受探针浓度、激发光强、组织散射干扰的定量优势。通过相量（phasor）分析可以发现细胞内源性成分的自发荧光和与特异性靶分子结合的荧光团存在空间重叠。本研究使用脉冲激光激发组织，比较两者的荧光寿命衰减曲线并将其转换为相量图。在二维相量图中，不同的信号根据各自的荧光寿命特征被映射到不同位置，通过计算对免疫荧光进行准确地量化，并将其与自发荧光分离。

FLIM的工作原理（源自文献：doi: 10.1038/s41598-025-89142-6）

为验证该方法，研究人员将已知具有较高自发荧光水平的肺癌、乳腺癌和正常皮肤组织进行免疫荧光，抗体使用CD3-AlexaFluor 555。并将本方法与化学辅助光漂白法（PB）和高光谱成像法（HS）进行对比。高光谱成像和荧光寿命成像（FL）在同一张组织切片上完成。结果显示，不同方法在各类组织中降低自发荧光的能力存在差异，且FL结果与IHC图像接近。

不同自发荧光降低技术对比结果（源自文献：doi: 10.1038/s41598-025-89142-6）

本研究实现了在不降低免疫荧光信号分辨率的情况下降低自发荧光的干扰，可观察精细的细胞结构。但是FLIM还需要解决数据采集、分析过程复杂，需要专业知识对结果进行准确处理和解读，且设备硬件需求也将会限制其应用。

参考文献：

Olga, Evgeny and Sergey. The Effect of Trypan Blue Treatment on Autofluorescence of Fixed Cells.Cytometry Part A, 2017. DOI: 10.1002/cyto.a.23199

Hwang W, et al. A robust method for autofluorescence-free immunofluorescence using high-speed fluorescence lifetime imaging microscopy. Scientific Reports. 2025. https://doi.org/10.1038/s41598-025-89142-6