脑组织的体积从啮齿类的1cm3到人脑的1500cm3，冰冻切片会出现一系列问题：冷冻不均匀、组织开裂、出现空泡、产生冷冻伪影等等。常规的干冰、异戊烷、液氮等方法能实现啮齿类、小型灵长类动物脑组织的冷冻，但在大体积脑组织难形成标准化操作。组织体积越大，冰冻耗时越长，形成冰晶造成组织损伤的可能就越大。

对整个脑组织进行冷冻和染色？！这篇文章的作者也真够敢想的。文章以羊脑为实验对象，并用优化的冷冻切片方案分析了一例人类脑组织标本。该人脑标本的尸检及脑组织取材操作严格遵循《赫尔辛基宣言》，并在取得患者直系亲属正式知情同意后开展，实验方案已通过相关伦理委员会审批。

一、搭建整脑组织冰冻平台

研究人员搭建专用的技术平台，主要包括与脑组织尺寸匹配的定型母模、铜质底座模具、冷冻体系及温度实时监测系统。这套平台可以实现大体积完整脑组织均匀冷冻，减少冰晶伪影。

脑组织定型母模通过颅脑磁共振成像（MRI）及离体脑组织三维表面扫描获取建模数据，用金属3D打印加工成型。包埋介质能够复刻脑组织外形凹槽，将整个脑组织放入模具后实现切片的定位。

研究人员定制了多种规格的铜制模具，用于脑组织和包埋剂的盛放。铜具有良好的导热系数且不会变形，可拆卸底板方便取出含有组织样品的冷冻包埋块。

冷冻体系主体是不锈钢容器，用于盛放异戊烷。将其置于泡沫保温箱内，四周填充干冰，温度可降至-80℃。冰冻过程会实时监测冷源温度，测温传感器精度可达±0.25℃。

大体积组织冰冻技术平台（源自文献：A technology platｆorm for standardized cryoprotection and freezing of large-volume brain tissues for high-resolution histology）

二、脑组织固定与脱水处理

对大体积组织标本进行冰冻切片前，建议进行固定。本次研究使用溶于0.01 mol/L 磷酸盐缓冲液（PB）的4%多聚甲醛（PFA）完成固定。山羊脑组织分离取出后，放入PFA固定液中浸泡两周。

固定后采用蔗糖梯度溶液对脑组织进行脱水处理。蔗糖溶液的浓度依次为：含4% PFA的10% 蔗糖溶液、溶于0.01 mol/L 磷酸盐缓冲液的20%与30%蔗糖溶液。每一梯度蔗糖脱水的终点判定标准是标本完全沉底，组织内外渗透压达到平衡。

三、整脑组织冷冻操作流程

研究人员先制备了冷冻模具。在装有干冰的泡沫保温箱中放入装有异戊烷的不锈钢容器，并将温度感应器固定好。向异戊烷中加入干冰使其温度降至-80℃。异戊烷在降至目标温度时会出现沸腾现象，溢出并流入模具。为降低风险，要测算容器内异戊烷的量。

注：这一步是整个实验设计的败笔。干冰是不能加到异戊烷中的。正如文中所说，两者直接接触会瞬间气化产生飞溅，一不小心就会冻伤皮肤。并且异戊烷属于易燃有机溶剂，飞溅后遇静电、热源有可能引发火情。

建议先在泡沫箱底部铺上干冰，然后将装有异戊烷的不锈钢烧杯置于其上。烧杯用镊子或铁架台固定。持续在烧杯周围填充碎干冰。静置降温5-10min，异戊烷会出现轻微粘稠、表层结薄霜的状态，这时温度能达到-80℃。

将脑组织定型母模与铜质底座模具组装，沿定型母模四周加入OCT包埋剂。包埋剂高度至母模总高度的95%。操作过程要小心，不能产生气泡，也要避免包埋剂流入定型母模内部型腔。

等异戊烷温度降至-80℃，将添加包埋剂的模具置于容器中央进行冷冻。待包埋剂完全冰冻后，将模具取出。使用热风枪轻微加热定型母模，使其与包埋剂分离，在包埋剂内部形成与脑部表面形态匹配的阴模型腔。

将脑组织小心的从蔗糖溶液中取出，放至模具新成型的阴模型腔中。操作过程中脑组织不能触碰到模具内壁。先在脑组织表面涂一层包埋剂，避免其产生剧烈的温度差，然后注满包埋剂。将模具放入异戊烷容器中进行冷冻。完全冻结的包埋剂为不透明白色。取出模具后先拆下底板，再从冷冻块顶部轻推，将脑组织冷冻包埋块完整脱出模具。对包埋块进行标记后，将其移植-80℃冰箱至少保存24小时，使组织整体冻透。

整体脑组织冷冻切片操作步骤（源自文献：A technology platｆorm for standardized cryoprotection and freezing of large-volume brain tissues for high-resolution histology）

四、冰冻切片染色验证

这一优化实验方案用于一例成年人大脑标本检测。样本整体为150×110×42mm，经过蔗糖梯度脱水法处理后进行异戊烷-干冰冷冻，获得796cm3的包埋块。研究人员使用大型冷冻切片机获得大尺寸（6英寸×8英寸）、厚度20μm的切片，进行Nissl和HE染色。Nissl染色即尼氏染色，用于标记神经元形态和尼氏小体，是神经组织形态学观察常用技术。

本研究选择额叶皮层、背侧皮层、枕叶皮层等多处脑组织区域进行组织学检测，结果显示结构完整。高倍镜下神经元轮廓清晰、各类脑细胞形态完整，没有明显的组织损伤。

源自文献：A technology platｆorm for standardized cryoprotection and freezing of large-volume brain tissues for high-resolution histology

五、蔗糖梯度脱水的保护作用

本文还以蔗糖梯度溶液和甘油联合二甲基亚砜（DMSO）混合液为冷冻保护液，对冰冻切片的防冻保护进行了研究。样品均采用平衡梯度法，蔗糖溶液依次为多聚甲醛配制的10%蔗糖溶液、0.01 mol/L 磷酸盐缓冲液配制的20%与30%蔗糖溶液。DMSO梯度液分别为含2% DMSO的10%、20%甘油溶液。每一梯度均需组织完全沉降值容器底部后，再转入更高浓度的溶液中。山羊整脑的蔗糖梯度脱水约需12天，DMSO约6天。

Nissl染色结果显示，蔗糖处理的大脑皮层切片染色均匀，没有冷冻伪影。高倍镜下神经元染色清晰、形态保存完好，而甘油-DMSO处理的脑组织易破裂，高倍镜下细胞出现渗透压损伤，可见微小裂缝。

上半部为蔗糖梯度处理，下半部为甘油-DMSO处理（源自文献）

冰冻切片蔗糖梯度脱水小结

结合上文内容，我们对蔗糖梯度脱水的应用进行一下总结。这里所说的“脱水”，不是石蜡切片中的酒精脱水。蔗糖脱水的目的是对组织进行抗冻保护。10%、20%、30%梯度处理，能够防止局部收缩、边缘皱缩或组织结构不均一。

哪些组织样本需要进行蔗糖梯度处理呢？

经过甲醛或福尔马林固定的组织需要蔗糖脱水处理。脑和脊髓的神经组织脂质含量多，建议先固定再冰冻，可以保持组织的韧性，减少空泡和裂隙。眼球、肾脏、肝脏等水分含量高、结构复杂的组织，建议先固定再冰冻，通过蔗糖梯度脱水后能够减少精细结构的损伤。有些肿瘤组织，坏死区域比较多，局部含水量、细胞密度和纤维成分差异大，直接冷冻容易出现破裂的情况，建议先固定，蔗糖梯度脱水后再进行冷冻。

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