在免疫学研究中，以体液免疫和细胞介导的免疫应答综合分析为基础，对感染性疾病、自免疾病病、疫苗效力等进行深入研究。如何准确检测体液中游离的细胞因子或抗体，对免疫应答做出评估，是选择实验方法的重要指标。

ELISpot（即酶联免疫斑点检测）在ELISA基础上，结合细胞培养技术，衍生出的高灵敏度免疫检测方法。它能够在单细胞水平检测分泌细胞因子的细胞频率。分泌靶点因子的阳性细胞会在膜上形成可计数的斑点，反映出有多少个细胞参与了免疫应答。

ELISpot操作简单，基本与ELISA类似。通过常规细胞培养获得低渗裂解细胞后，进行抗体孵育和Streptavidin-ALP酶标记，完成显色反应后读数。ELISpot的难点可能在读数，需要专业的判读标准和设备仪器。

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01ELISpot：从细胞分泌到斑点计数

ELISpot巧妙地将细胞培养、抗体捕获及酶促显色结合在一起，具有单细胞水平的分辨率。它将某个细胞是否被激活、是否正在分泌靶蛋白转化为直观的“斑点形成单位（SFU）”数值，能够检测低频免疫应答。在检测抗原特异性T细胞、疫苗诱导的Th1型应答或肿瘤相关抗原刺激后的T细胞功能筛查时，ELISpot比仅测定上清浓度的ELISA更接近细胞活性频率。

那么，我们在进行研究时如何选择合适的检测方法呢？

· ELISA：如果需要检测细胞因子总体分泌水平，建议使用ELISA。

· ELISpot：如果是要了解这群细胞中有多少细胞因抗原刺激而造成分泌水平变化，或对低频抗原特异性细胞应答进行筛查，建议优先考虑ELISpot。

· FCM：如果是要知道应答细胞来自哪类亚群及标志物等多参数信息时，需要选择流式细胞术（FCM）

· TR-FRET：如果是大样本、多批次的高通量检测需求，建议试一试TR-FRET（时间分辨荧光共振能量转移技术）。义翘神州TR-FRET试剂盒上市，推出0元试用活动，点击免费申请100 Tests试剂盒。

实验的需求是多种多样的，我们的实验选择也是多样的。在项目开发过程中，我们要根据实际需求进行选择和结合，ELISpot与ELISA、FCM、TR-FRET等实验技术形成互补，而不是替代。

02ELISpot在研发中的应用案例

01在疫苗研发中的应用

目前，已有多项指导原则推荐使用ELISpot检测细胞的免疫反应。例如，CDE发布《新型冠状病毒预防用mRNA疫苗药学研究》，中国食品药品检定研究院发布《预防用DNA疫苗临床前研究技术指导原则》及《预防用以病毒为载体的活疫苗制剂的技术指导原则》。国际艾滋病疫苗行动计划中监测新型HIV疫苗的试验推荐使用ELISpot技术。

IFN-γ是疫苗研发中常用ELISpot检测的一个指标。机体在接种疫苗后，IFN-γ的表达水平直接反映辅助性T细胞的活化状态。ELISpot通过测量T细胞反应能力来定义疫苗效果。通过检测细胞分泌IL-2、TNF-α、IL-4、IL-5等痕量细胞因子的表达水平，可进一步分析免疫反应偏向性，深入理解疫苗引起的免疫应答机制。

02在细胞免疫治疗开发中的应用

ELISpot技术可用于CAR-T产品开发阶段检测T细胞免疫应答功能的测试，比如IFN-γ、IL-2、TNF-α等细胞因子分泌水平评估。Hu等人在开发靶向CD19的CAR-T疗法过程中，利用IFN-γ ELISpot分析11名患者外周血免疫反应情况，结果显示双敲除DKO和低免疫原性HIP的CAR-T细胞未激活T细胞，而野生型WT细胞强烈激活T细胞，并在第28天达到峰值。证实HIP CAR-T细胞不会引发免疫反应，有效逃避免疫系统的排斥反应。

ELISpot检测患者外周血的结果

（源自文献：doi: 10.1016/j.stem.2025.07.009）

03在其他领域的更多应用

Kathryn团队通过优化的IFN-γ ELISpot方法，监测腺病毒（AAV）基因疗法的细胞免疫反应情况。在一项AAV5-FVIII基因治疗临床试验中，给药2周后，可在大多数受试者中检测到靶向AAV5衣壳蛋白的免疫反应。

Oxford Immunotec公司基于ELISpot原理开发的T-SPOT.TB结核病诊断试剂盒已获FDA批准，用以定量检测患者血液或体液样品中结核效应T细胞数，判断患者结核分枝杆菌感染状态。它可以代替传统的皮肤测试，并且不受卡介苗接种的影响。

ELISpot技术也可用于自身免疫性疾病的诊断和机制研究中，如I型糖尿病、多发性硬化、重症肌无力、系统性红斑狼疮等，分析异常的免疫细胞激活和细胞因子分泌谱。

义翘神州ELISpot试剂盒

ELISpot实验体系需要标准化。细胞活率、抗原刺激条件、阴性与阳性对照、洗板强度、显色时间、读板参数、背景扣除方式等都有可能影响读板结果（SFU值）。

义翘神州ELISpot检测试剂盒正是围绕这一痛点设计。其预包被ELISpot检测试剂盒经PVDF板包被、无菌干燥、真空密封包装等流程制备，可检测IFN-γ、IL-2、IL-4等多种关键细胞因子。试剂盒即用型预包被，具有重复性高、检测流程简单、超高灵敏度等特点，是检测人源或鼠源细胞因子优先考虑的标准化方案。

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【参考文献】

1. Hu X, et al. Hypoimmune CD19 CAR T cells evade allorejection in patients with cancer and autoimmune disease. Cell Stem Cell. 2025. doi: 10.1016/j.stem.2025.07.009

2. Patton KS, et al. Monitoring cell-mediated immune responses in AAV gene therapy clinical trials using a validated IFN-γ ELISpot method. Mol Ther Methods Clin Dev. 2021 doi: 10.1016/j.omtm.2021.05.012

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