【产品规格】

BPT50 50T(50人份 ，其中5个组分按5个10人份单独包装，Biowing® Specific Reverse Transcription Primer按20µL*2单独包装。)

【产品说明】

端粒酶 (Telomerase ) 是一种酶促核糖蛋白复合物。其催化亚基 (TERT) 具有逆转录酶的特

性，TERT被认为是端粒酶活性表达的关键组分，其编码的mRNA水平与端粒酶活性一致，与端粒酶的活化程度密切相关。因此，对端粒酶催化亚基的检测可以间接反映样本中端粒酶活性。

本产品试剂盒采用双色荧光qPCR(TaqMan探针法) 检测端粒酶催化亚基TERT基因和内参基因***DH 。通过提取细胞RNA ，利用特异性逆转录引物进行逆转录反应， 以cDNA为模板在单管中利用多重荧光定量PCR进行扩增反应 (双重探针：FAM 、Cy5) 。选用293T细胞为阳性对照以及MRC-5细胞为阴性对照，判断样本中是否有TERT基因表达。该试剂盒具有以下特点：

1. 灵敏：双色探针，灵敏度高。

2. 稳定：全程闭管操作，无交叉污染。

3. 可靠：含内参基因，避免假阴性。

4. 方便：操作简单，无需电泳步骤。

5. 定量： 以CT值判断，可定量检测。

【运输及保存条件】

低温冷冻运输 ，避光-20℃保存 ，有效期6个

月。开盖后，4℃保存，有效期1周。

【产品组分】

注：1.本试剂盒提供试剂，使用先低速离心、后小心开启。使用时请上下轻柔颠倒十次混匀，避免起泡，并低速短暂离心后使用；2.为了避免反复冻融，10人份/管作为一个包装。

【操作步骤】

1. 逆转录反应

使用Trizol法抽提细胞RNA ，RNA纯度A260/280在1.9-2.0之间。取1ug RNA使用Thermo逆转录试剂盒(货号：K1622 )，将试剂盒中的 Random Primer 替换成Biowing® Specific Reverse TranscriptionPrimer进行反转录反应得到cDNA。

1. 1 DNase I处理

反应程序：37℃ 30min ；加 EDTA 1 µL 后，65℃，10min

1.2 逆转录反应

反应程序：20℃ 10min ；42℃ 1h；72℃ 5min

2. qPCR反应体系及条件

2. 1 阳性对照处理

将阳性对照cDNA进行4倍、8倍的梯度稀释，每个梯度建议三重复。

2.2 阴性对照处理

将阴性对照cDNA进行4倍、8倍的梯度稀释，每个梯度建议三重复。

2.3 样本处理

将待测样本cDNA进行4倍稀释作为测试浓度，每个样本做三重复。

反应体系 (以20µL为例)

PCR仪设置 (以ABI 7500为例)

【基线设置】(以ABI 7500为例)

一般默认起始和终止基线位置为3- 15个循环，应根据内参基因和TERT基因实际扩增曲线手动将基线起始循环数调整为指数增之即可。

【阈值设置】(以ABI 7500为例)

内参阈值设定： 以阳性对照4倍稀释cDNA定内参基因扩增曲线阈值， 内参基因(Cy5)初始浓度的CT值定 为17±3；

TERT阈值设定： 以阳性对照4倍稀释cDNA定TERT基因扩增曲线阈值，TERT基因(FAM)初始浓度CT值的定为25±3。

【结果判读】

图1左: 阳性对照的扩增曲线；右: 阴性对照的扩增曲线

(蓝色为TERT基因曲线,黄绿色为内参基因曲线)

1. 阳性对照4倍稀释后TERT基因Ct值在25±3，内参基因Ct值在17±3，8倍稀释后TERT基因Ct值在26±3，内参基因Ct值在18±3。TERT基因和内参基因之间∆CT维持在9±3，保持稳定。

2. 阴性对照经4倍、8倍梯度稀释后，TERT基因Ct值≥35 (或检测不到) ，内参基因Ct值仍在18±3之间，判定为端粒酶活性为阴性。

3. 结果说明

若待测样本内参基因Ct值在17±3之间，TERT基因Ct值＜35且扩增曲线正常，则样本端粒酶活性为阳性。

若待测样本内参基因Ct值在17±3之间，TERT基因Ct值≥35且无明显的扩增曲线，则样本无端粒酶活性。

【说明】

1. 待测样本cDNA 4倍稀释作为模板，三次技术重复，不设置梯度稀释；阳性对照、阴性对照进行4倍、8倍梯度稀释，建议分别做三重复；避免偶然误差的产生。

2. 如果阳性/阴性对照4倍稀释后内参基因Ct值＞20，表明参考品有降解或者试剂盒扩增效率下降。

3. 如果所有样本4倍稀释后内参基因Ct值＞20，表明试剂盒的扩增效率下降。

4. 如果阳性对照4倍稀释后TERT基因Ct值＞28 ，表明TERT基因检测系统失效。