DNA载体可使目的基因在细胞内表达以达到我们的研究目的。

人工改造的 质粒是最常用的载体之一，通常具有以下几个特点：

1. 有一个或多个限制性内切酶的切点，便于目的基因插入；

2. 带有标记基因（抗性基因、荧光基因等），便于筛选；

3. 大小合适（一般小于10kb），便于转染。

载体质粒示例：

MCS（multiple cloning site）：多克隆位点外源基因插入；

CMV启动子（以及SV40、bla、T7、U6……）：高效率启动基因表达；

SV40 polyA信号（以及TK polyA……)：转录终止，给mRNA添加polyA尾防降解；

neomycin/kanamycin resistance ORF 新霉素(G418) /卡那霉素抗性 (以及Ampicillin氨苄、puromycin嘌呤霉素……）：用于细菌转化/细胞转染后的筛选。
选择限制性内切酶构建载体应注意：

1. 单酶切后载体容易自连必须去磷酸化， 不能保证插入片段的方向；

2. 双酶切需要注意同尾酶的自连。

表达基因扩增的 引物设计：

1. NCBI Gene 数据库查找基因cDNA序列；

2. 查找CDS区序列的酶切位点，对比载体上的酶切位点，避免冲突

3. CDS区首、尾序列+ 5’端加上酶切位点和（或） 保护碱基

表达载体构建 简要流程

1. PCR扩增出基因CDS区，1400bp左右，胶回收；

2. 双酶切胶回收产物及载体，胶回收；

3. 酶切后的产物用T4连接酶(Takara) 连接过夜，转化，鉴定。

常见问题

1. 引物特异性不好，PCR杂带太多或根本扩增不出来

在CDS区的上下游重新选择引物，扩增成功后，以这个大一点的片段为模板扩增CDS区；

人基因ORF库购买。

2. PCR产物酶切不成功

构建克隆载体，再酶切；

载体自连会使Lac Z编码，在IPTG/X-Gal平板上呈现蓝色。

3. 没有合适的酶切位点

无缝克隆试剂盒。

4. 没有合适的抗体

加上标签，翻译成融合蛋白，比如His、HA、Flag、Myc等，N端C端均可；

引物设计：CDS区序列，5’端依次加上标签序列、酶切位点和（或）保护碱基；

载体自带标签，需要注意酶切位点处可能移码。

点突变质粒

1. 使用高保真酶进行定点突变：PrimeSTAR Max DNA polymerase

PCR合成突变质粒，DpnI消化模板质粒，转化培养，后续测序鉴定。

2. 使用无缝克隆连接进行定点突变：

PCR扩增出突变的线性化载体，无缝克隆连接成环状质粒，转化培养，后续测序鉴定。

原理提要

1. 切割区的选择在于PAM序列-NGG；

2. 特异性在于sgRNA的20个碱基；

3. Cas9失活：D10A、H840A突变。

sgRNA设计

1. NGG序列前面，长度20nt左右；

2. GC含量在40-60%之间；

3. 尽量以G碱基开始，最后7个碱基的靶向性要好；

4. 尽量靠近基因编码区的ATG下游，第一或第二外显子。

CRISPR/Cas9质粒的构建

1. 线性化载体；

2. sgRNA双链结合；

3. sgRNA与载体连接；

4. 菌P鉴定。

基因敲除效果鉴定

1.Western检测蛋白表达量；

2.双sgRNA敲除，间隔200-500bp左右。鉴定引物设计在两个gRNA外侧。