分光光度法50管/48样

注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。

测定意义：

GSH-Px是谷胱甘肽氧化还原循环中催化还原型谷胱甘肽（GSH）氧化的主要酶之一。GSH-Px

不仅能够特异地催化还原型谷胱甘肽与ROS反应，生成氧化型谷胱甘肽GSSG，从而保护

生物膜免受ROS的损害，维持细胞的正常功能；而且具有保护肝脏、提高机体免疫力、拮

抗有害金属离子对机体的伤害和增加机体抗辐射等能力。

测定原理：

GSH-Px催化H₂O₂氧化GSH，产生GSSG；谷胱甘肽还原酶（GR）催化NADPH还原GSSG，

再生GSH，同时NADPH氧化生成NADP⁺；NADPH在340nm有特征吸收峰，而NADP⁺

没有；通过测定340nm光吸收减少速率来计算GSH-Px活性。

自备仪器和用品：

紫外分光光度计、低温离心机、水浴锅、可调节移液器、1mL石英比色皿和蒸馏水。

试剂组成和配置：

试剂一：液体100mL×1瓶，室温保存。

试剂二：粉剂×1瓶，4℃保存。

试剂三：液体20μL×1支，-20℃保存。

混合试剂配制：临用前，在试剂二中加入试剂一40mL，充分震荡溶解后加入全部试剂三，

混匀。（注意：必须现配现用，当天使用完）

试剂四：液体5.1mL×1瓶，4℃保存。

粗酶液提取：

1.组织：按照组织质量（g）：试剂一体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，

加入1mL试剂一）进行冰浴匀浆。8000g，4℃离心10min，取上清置冰上待测。

2.细菌、真菌：按照细胞数量（10⁴个）：试剂一体积（mL）为500~1000：1的比例（建

议500万细胞加入1mL试剂一），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7

秒，总时间3min）；然后8000g，4℃，离心10min，取上清置于冰上待测。

3.血清等液体：直接测定。

测定操作：

1.分光光度计预热30min，调节波长到340nm，蒸馏水调零。

2.混合试剂在25℃或者37℃（哺乳动物）水浴中预热30min。

3.测定管：依次在1mL石英比色皿中加入100μL试剂四、800μL预热的混合试剂、100μL

上清液，迅速混匀后于340nm处测定第10s和第190s的吸光值，分别记为A测1和A测

2，△A测定管=A测1﹣A测2。

计算公式：

(1).按蛋白浓度计算

GSH-Px活力单位定义：一定温度中，每mg蛋白每分钟催化1nmolNADPH氧化为1个酶

活单位。

GSH-Px(nmol/min/mgprot)=[△A测定管÷ε÷d×V反总×10⁹]÷（Cpr×V样）÷T

=536×△A测定管÷Cpr

(2).按样本质量计算

GSH-Px活力单位定义：一定温度中，每g样本每分钟催化1nmolNADPH氧化为1个酶活

单位。

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GSH-Px(nmol/min/g)=[△A测定管÷ε÷d×V反总×10⁹]÷(W×V样÷V样总)÷T

=536×△A测定管÷W

（3）按细胞数量计算

活性单位定义：一定温度中，每10⁴个细胞每分钟催化1nmolNADPH氧化为1个酶活单位。

GSH-Px(nmol/min/10⁴cell)=[△A测定管÷ε÷d×V反总×10⁹]÷(细胞数量×V样÷V样总)÷T

=536×△A测定管÷细胞数量

（4）按液体体积计算

活性单位定义：一定温度中，每毫升液体每分钟催化1nmolNADPH氧化为1个酶活单位。

GSH-Px(nmol/min/mL)=[△A测定管÷ε÷d×V反总×10⁹]÷V样÷T

=536×△A测定管

ε：NADPH摩尔消光系数6.22×10³L/mol/cm；V反总：反应体系总体积，1000μL=0.001L；

10⁶：1mol=1×10⁶μmol；Cpr：上清液蛋白浓度（mg/mL）；V样：加入反应体系中上清液体

积，100μL=0.1mL；V样总：加入提取液体积，1mL；W，样本质量，g；T：反应时间，3

min。

注意事项：

（1）样品处理等过程均需要在冰上进行，且须在当日测定酶活力；

（2）混合试剂和底物液须临用前配制，配完后置于冰上，当天使用完；

（3）测定过程操作须迅速；

（4）细胞中GSH-Px活性测定时，细胞数目须在300万-500万之间，细胞中GSH-Px的提

取时可加试剂一后研磨或超声波处理，不能用细胞裂解液处理细胞。