如何得到可靠的泛素化数据？

泛素-蛋白酶体系统在20世纪80年代初被发现，至此人们一直着力研究。初，研究人员认为用泛素标记蛋白是细胞蛋白通过蛋白酶体而报废的信号。但更多的研究表明，像所有的生物学一样，一旦开始接近，这种翻译后修饰比我们想象的复杂得多。

泛素可以结合到靶蛋白的赖氨酸上。一些泛素链是蛋白再循环的信号，一些参与细胞周期调节，一些在细胞信号传导中起作用，一些还未被很好地理解。单泛素化，多样单泛素化和不同长度的多泛素链，从哪里开始研究这个系统很是棘手。

如果你知道你的蛋白是泛素化的，你想研究一下，或者WB上一个拖尾提示目标蛋白很可能泛素化，你想确认，那么如下提示可能会帮助你得到可靠的数据和更快了解这种翻译后修饰。


（一）样本制备
在提取样品之前，有一些事情需要考虑，以确保不会错过泛素信号，或是得到假的泛素信号。当涉及样品制备时，抑制剂很重要。
蛋白泛素化是可逆的，并且泛素链可以被潜伏在细胞内的去泛素酶降解。添加去泛素化酶抑制剂到细胞裂解液将阻止去泛素化酶降解目标蛋白上的标签。

细胞裂解液中应该包含乙二胺四乙酸（EDTA）或乙二醇四乙酸（EGTA）和N-乙基马来酰亚胺（NEM）。虽然许多的裂解缓冲液配方包括5-10mM浓度的NEM，但这对于一些泛素链是不够的。 K63链是特别敏感的，需要高达10倍的NEM浓度才能适当地保存K63链在样本中。


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蛋白酶体抑制剂是必需的。除了K63和M1，所有泛素链可以靶向蛋白酶体。需要在裂解缓冲液中加入蛋白酶体抑制剂，以阻止蛋白酶体切碎泛素化蛋白。

常见的蛋白酶体抑制剂是MG132，但是要小心，因为长期使用（12-24小时）可能意味着泛素链开始出现作为细胞应激反应的一部分，然后得到完全不同的结果。


（二） 免疫印迹准备
鉴定泛素化常见的技术之一是WB。每个泛素分子可增加8kDa 分子量，甚至可以高达400kDa。然而，破译所链接的单个分子的数目以及了解如何链接是棘手的。如下几个注意事项能帮助了解目标蛋白到底发生了什么？


如果使用单梯度凝胶进行SDS-PAGE，则8％凝胶与tris-甘氨酸缓冲液配合是一个很好的选择，这类凝胶能很好的分离超过20个泛素单位的泛素链。如果你感兴趣的是更小的链和单泛素化，那么使用12％的凝胶可以更好的分离。


更换免疫印迹缓冲系统也可以帮助区分不同小的泛素链。如果你想看到超过8个泛素单位的链，3-（N-吗啉代）丙磺酸（MOPS）是理想的缓冲物质。如果感兴趣的蛋白用小的泛素链装饰，比如在2和5单位之间，那么你需要2-（N-吗啉代）乙磺酸（MES）。


总是尝试使用PVDF膜进行泛素印迹，因为来自PVDF膜的信号强度往往高于硝酸纤维素膜。此外，如果你在寻找更小的泛素链，选择0.2微米的孔径。


对于长的泛素链，优化转印步骤可以有所帮助。在30V下转移2.5小时是理想的。比这更快的转移速度可以导致泛素链展开，这意味着任何用于寻找特定泛素链的抗体可能不会与目标结合，导致数据丢失。

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