信帆生物提供：免疫荧光单标染色实验技术服务

信帆生物主营产品: 质控样品，干扰物质，抗体抗原，elisa试剂盒，动物血制品，生化试剂盒等。实验代做服务：HE染色/特殊染色/技术服务、免疫组化实验服务、Western blotting实验服务、RT-PCR实验技术服务,QPCR(荧光定量PCR）、酶联免疫ELISA、生化测试、液相气相检测等。

免疫荧光单标染色是免疫荧光最基础的实验技术，仅选用一种靶蛋白特异性一抗搭配单一荧光二抗，实现单个目标抗原的原位可视化检测。实验一般经过组织/ 细胞固定、通透、封闭、一抗孵育、荧光二抗结合，常辅以 DAPI 复染细胞核作为形态参照。借助荧光显微镜或共聚焦显微镜，可直观观察靶蛋白在细胞、组织中的表达位置。该方法操作简便，无抗体交叉反应隐患，背景易把控，多用于一抗有效性验证、蛋白亚细胞定位分析，缺点是单次仅能检测一种蛋白，无法直接开展蛋白共定位研究。

实验原理（仅供参考）：

免疫荧光单标染色基于抗原/抗体特异性结合反应。利用针对目标蛋白的特异性一抗，与样本内靶抗原特异性结合；再加入偶联单一荧光基团的二抗，二抗可识别并结合一抗的恒定区。后续可使用DAPI对细胞核复染作为定位参照。在荧光显微镜激发光作用下，荧光基团发射特定波长荧光，荧光信号位置即代表靶蛋白的分布区域，以此实现目标蛋白在细胞或组织中的原位定位观察。

实验步骤（仅供参考）：

1. 固定：样本用4%多聚甲醛固定，PBS清洗去除固定液。

2. 通透：滴加Triton X-100通透，使抗体能够进入细胞内部。

3. 封闭：滴加封闭液室温封闭，减少抗体非特异性结合。

4. 一抗孵育：加入目标蛋白特异性一抗，4℃孵育过夜，PBST洗涤。

5. 二抗孵育：滴加荧光标记二抗，室温避光孵育，PBST洗涤。

6. 核复染：DAPI染色标记细胞核，PBS清洗多余染料。

7. 封片：滴加抗淬灭封片剂封片。

8. 成像：荧光显微镜或共聚焦显微镜观察拍照。

注意事项：

1、避光操作：荧光二抗、DAPI遇光易淬灭，二抗孵育、染色、封片全程避光。

2、抗体孵育：一抗、二抗孵育时防止液体干片，干片会造成极强非特异性背景。

3、洗涤环节：PBST充分漂洗，洗去未结合抗体，降低背景噪音；洗涤动作轻柔，避免切片脱落。

4、通透条件：胞膜蛋白可降低Triton X-100浓度；胞内蛋白需保证通透充分，防止染色信号偏弱。

5、封闭选择：二抗来源同源血清做封闭液，优于BSA，可有效减少非特异结合。

6、封片保存：使用抗荧光淬灭封片剂；短期4℃避光存放，长期可- 20℃避光保存，尽快成像。

7、阴性对照：设置不加一抗只加二抗的空白对照，区分特异性信号与自发荧光。

8、样本自发荧光：部分组织自带自发荧光，可提前设置空白切片观察，必要时做淬灭预处理。