分光光度法 50管/48样

注意：正式测定之前选择 2-3个预期差异大的样本做预测定。

测定意义：

POD（EC 1.11.1.7）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，可催化过氧化氢氧化酚

类和胺类化合物，具有消除过氧化氢和酚类、胺类毒性的双重作用。

测定原理：

POD催化H₂O₂氧化特定底物，在470nm有特征光吸收。

需自备的仪器和用品：

可见分光光度计、台式离心机、可调式移液器、1mL玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水

试剂的组成：

提取液：液体 60mL×1瓶，4℃保存；

试剂一：液体 60mL×1瓶，4℃保存；

试剂二：液体×2瓶，4℃保存；用时每瓶加入5mL试剂一，现配现用；

试剂三：液体10mL×1瓶，4℃保存。

粗酶液提取：

1、细菌、细胞或组织样品的制备：

细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议 500万细菌或细胞加入1mL提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 20％或 200W，超声 3s，间隔10s，重复30次）；8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，

加入1mL提取液），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

2、血清（浆）样品：直接检测。

测定步骤和加样表：

1、分光光度计预热30min以上，调节波长至470nm,蒸馏水调零。

2、测定前将试剂一、试剂二、和三在37℃（哺乳动物）或25℃（其他物种）放置10min以上。

3、样本测定表

在1mL玻璃比色皿中按顺序加入上述试剂，立即混匀并计时，记录470nm下30s时的吸光值A1和1min30s后的吸光值A2。计算ΔA＝A2-A1。

注意：

1、若一次性测定样本较多，可将试剂一、二、三和蒸馏水按比例配成混合液，在37℃（哺乳动物）或 25℃（其它物种）放置10min以上，测定时加入15µL样本和1055µL混合液测定。

2、如果ΔA小于0.005，可将反应时间延长到5min。如果ΔA大于0.5，可将样本用提取液稀释后测定，计算公式中乘以相应稀释倍数。

POD活性计算：

1、血清（浆）POD活性

单位定义：每mL血清（浆）在每mL反应体系中每分钟A470变化0.01为一个酶活力单位。

计算公式：

POD（U/mL）=ΔA×V反总÷V样÷0.01÷T =7133×ΔA

2、组织、细菌或细胞 POD活性

(1)按样本蛋白浓度计算

单位定义：每mg组织蛋白在每mL反应体系中每分钟A470变化0.01为一个酶活力单位。

POD（U/mg prot）＝ΔA×V反总÷（V样×Cpr）÷0.01÷T =7133×ΔA÷Cpr

（2）按样本鲜重计算

单位定义：每g组织在每mL反应体系中每分钟A470变化0.01为一个酶活力单位。

POD（U/g鲜重）＝ΔA×V反总÷(W×V样÷V样总)÷0.01÷T =7133×ΔA÷W

（3）按细菌或细胞密度计算

单位定义：每1万个细菌或细胞在每mL反应体系中每分钟A470变化0.01为一个酶活力单位。

POD（U/10⁴ cell）＝ΔA×V反总÷(500×V样÷V样总)÷0.01÷T =14.27×ΔA

V反总：反应体系总体积，1.07mL；V样：加入样本体积，0.015mL；V样总：加入提取

液体积，1 mL；T：反应时间，1 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500万。