分光光度法 50管/48样

注意：正式测定之前选择 2-3个预期差异大的样本做预测定。

测定意义

CAT(EC 1.11.1.6)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，是最主要的H₂O₂清除酶，

在活性氧清除系统中具有重要作用。

测定原理

H₂O₂在240nm下有特征吸收峰，CAT能够分解H₂O₂，使反应溶液240nm下的吸光度随反应时间而下降，根据吸光度的变化率可计算出CAT活性。

自备实验仪器及用品

紫外分光光度计、台式离心机、可调式移液器、1mL石英比色皿、研钵、冰和蒸馏水

试剂的组成和配制

提取液：60mL×1瓶，4℃保存；

工作液：60mL×1瓶，4℃保存；

粗酶液提取：

1、细菌、细胞或组织样品的制备：

细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（10⁴个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

2、血清（浆）样品：直接检测。

测定步骤：

1、分光光度计预热30min以上，调节波长至240nm处，蒸馏水调零。

2、测定前将CAT检测工作液37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）水浴10min。

3、取1mLCAT检测工作液于1mL石英比色皿中，再加入35μL样本，混匀5s；室温下立即测定240nm下的初始吸光值A1和1min后的吸光值A2，计算ΔA=A1-A2

CAT活性计算：

1、血清（浆）CAT活力的计算:

单位的定义：每毫升血清（浆）每分钟催化1nmol H₂O₂降解定义为一个酶活力单位。

CAT(nmol/min/mL)= [ΔA×V反总÷（ε×d）×10⁹]÷V样÷T=678×ΔA

2、组织、细菌或细胞中CAT活力计算：

（1）按样本蛋白浓度计算：

单位的定义：每mg组织蛋白每分钟催化1nmol H₂O₂降解定义为一个酶活力单位。

CAT(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V反总÷（ε×d）×10⁹ ]÷(V样×Cpr)÷T=678×ΔA÷Cpr

(2)按样本鲜重计算：

单位的定义：每g组织每分钟催化1nmol H₂O₂降解定义为一个酶活力单位。

CAT(nmol/min//g鲜重)=[ΔA×V反总÷（ε×d）×10⁹ ]÷（W×V样÷样总）÷T=678×ΔA÷W

（3 ）按细菌或细胞密度计算：

单位的定义：每1万个细菌或细胞每分钟催化1nmol H₂O₂降解定义为一个酶活力单位。

CAT(nmol/min/10⁴cell)＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×10⁹]÷（500×V样÷V样总）÷T =1.356×ΔA

V反总：反应体系总体积，1.035×10^-3 L；ε：H₂O₂摩尔消光系数，4.36×10⁴L/mol/cm;d:

比色皿光径，1cm；V样：加入样本体积，0.035mL；V样总：加入提取液体积，1 mL；T：

反应时间，1 min；W：样本质量，g；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；500：细胞或细菌总

数，500万