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胸腺素a1抗体的制备及其效价测定

【摘要】 目的 制备用于检测胸腺素α1基因工程表达产物的特异性抗体。方法 以提纯的胸腺素α1与牛血清白蛋白偶联后作为抗原,皮下多点注射免疫大鼠。经过3个月的免疫,获得抗胸腺素α1的多克隆抗体。结果 用间接酶联免疫吸附（ELISA）方法,测定抗体效价超过5,000,显示该抗体能与胸腺素α1抗原特异性地产生明显免疫反应。结论 采用本法制备的抗体具有很好的灵敏性和特异性。为胸腺素α1的分离纯化及大规模生产，从而为进一步满足临床需要奠定了基础。

【关键词】 胸腺素α1抗体　酶联免疫吸附反应

　　胸腺素（Thymosin α1，Tα1）作为一种生物反应调节剂（BRM）〔1～4〕,在临床中具有良好疗效，主要治疗乙型肝炎〔5，6〕、丙型肝炎〔7〕及多种恶性肿瘤〔8，9〕，也用于艾滋病等免疫缺陷性疾病的治疗。制备Tα1特异性的抗体对于Tα1基因的表达产物的鉴定至关重要。本文用大鼠作为免疫动物,采用皮下多点免疫注射的方法，获得了满意的抗Tα1抗体。

1 　 材料与方法

11 　材料与试剂

Tα1购自市售成都地奥九泓制药厂,规格16 mg/瓶;牛血清白蛋白、完全福氏佐剂及不完全福氏佐剂、辣根酶标记山羊抗大鼠Ig G（H+L）均购自北京鼎国生物公司;大鼠,雌性，6～8周龄，225～234 g，由吉林大学基础实验动物室提供。

12 　 方法

121 　制备偶联复合体

　　用pH 74的01 mol/L PBS 缓冲液溶解Tα1和BSA,缓慢加入60%戊二醛、05 mol/L NaCl,使Tα1的终浓度为01 mg/ml,置于振荡器中轻微振荡3 h。

122 　 制备抗体血清

1221 　卡介苗致敏

　　在动物饲养室内饲养大鼠6只,观察2 w，其健康状态良好后,每只大鼠后足掌皮下注射005 ml卡介苗。

1222 　第1次免疫注射

　　卡介苗致敏2 w后,以BSATα1偶联产物做抗原,与等体积完全福氏佐剂充分乳化后,免疫注射。位点在大腿肌肉腹股沟处,每点皮下注射02 ml，阴性对照注射等量生理盐水。

1223 　第2次免疫注射

　　第一次免疫注射2 w后,选择脊椎两旁各4个位点,腹股沟各1点,每点02 ml进行皮下免疫注射。

1224 　第3次免疫注射

2 w后,免疫注射位点在背部脊柱旁各3个,腹股沟及腋下各1点,每点02 ml。

1225 　加强免疫

　　第3次免疫注射后,每隔20～25 d,以不完全福氏佐剂与Tα1BSA偶联复合物经充分乳化后进行背部多点免疫;最后1次免疫后的第7天采血,4℃冰箱过夜,离心分离血清。用ELISA法测定其效价,达到要求后,眼球取血,获得血清,分装保存在-20℃冰箱备用。

123　抗血清的纯化

　　用硫酸铵盐沉淀提纯抗体〔10～12〕。

1231　盐析

取分离后获得的血清与等量生理盐水混合稀释,于搅拌下逐滴加入等量的饱和硫酸铵,使其终浓度为50%,4℃冰箱过夜,使其充分沉淀。经离心后弃去上清，以生理盐水溶解沉淀。再逐滴加入饱和硫酸铵，使其终浓度为33%，4℃冰箱过夜。重复用50%及33%的饱和硫酸铵依次提取。将末次离心后所得沉淀物以002 mol/L PBS溶解后装入透析袋。

1232 　除盐

将盛装盐析物溶液的透析袋置于大烧杯中，在电磁搅拌下，以蒸馏水和生理盐水交替透析48 h,此过程每隔3～4 h换液。

124 ELISA法测定抗体效价

1241 　 包被

　　用pH 96碳酸盐缓冲液稀释Tα1至终浓度5 μg/ml,包被酶标板，将酶标板放入湿盒中，置4℃冰箱过夜。

1242 　封闭

　　封闭液用pH 74 PBSTween 20，加5%脱脂奶粉。

1243 　加一抗

　　以pH 74 PBSTween 20奶粉为稀释液,将免疫后的大鼠阳性血清作不同梯度稀释;阴性对照用未免疫的大鼠阴性血清。

1244 　加酶标二抗

　　用pH 74 PBSTween 20脱脂奶粉按1∶1 000稀释酶标二抗山羊抗大鼠HRP。

1245 　加底物

　　加入TMB显色液,37℃避光显色15～20 min后,加入2 mol/L H2SO4 终止反应。

1246 　读数

　　用酶标仪在490 nm波长下读取吸光值。每次操作间采用浸泡式洗涤方法充分洗涤3次，以除去多余的游离反应物。

13 　统计学处理

　　采用SPSS115软件包处理数据。

21　抗体的制备

　　本次实验所用大鼠在三个月的免疫过程中状态良好，无一例死亡，其免疫前后体重变化无明显差异（P＞005）见表1。免疫结束，每只大鼠眼球取血获得5～6 ml的免疫血清。表1 免疫前后大鼠体重变化（略）

22 　抗体的ELISA检测

　　以未免疫的大鼠血清作为对照，用制备的抗体作为一抗进行ELISA检测,均有阳性反应，均为P/N＞21（P:阳性血清OD490；N：阴性血清OD490）,测得OD值，见表2。表2 ELISA检测抗体效价（略）

23 胜一筹提纯抗体与未提纯抗体的比较

　　经采用相同针剂、相同条件以提纯和未提纯的抗体作ELISA检测,发现提纯的抗体其阳性反应明显比未提纯的抗体强。1∶10时，提纯抗体与未提纯抗体两组比较P＜001；1∶100、1∶1 000、1∶3 000、1∶5 000时，两组比较P＜005。证明提纯抗体特异性,灵敏度均比未提纯的效果好，检测结果见表3。表3　 提纯抗体与未提纯抗体的比较（略）

Tα1为免疫原性差的小分子量肽，而戊二醛能分别将药物与载体蛋白的伯氨基以五肽链的桥连接起来〔11〕，Tα1与载体蛋白偶联后免疫动物,能提高其免疫原性。选择大鼠做免疫动物的优点是,大鼠活力强,饲养条件要求较低,免疫中途死亡率低，本次实验所用大鼠在三个月的免疫过程中状态良好，均未死亡;此外,大鼠个体适中,所需抗原用量不大,而且其体积比小鼠大,收获血量相对多,制备的血清量大。本实验采用上述方法，从一只大鼠中可以获得5～6 ml的免疫血清。此外，制定合理的免疫程序也是获得理想抗体的关键，抗原免疫前使用卡介苗致敏,能够明显调动大鼠免疫系统,产生较强的免疫反应,并对产生高滴度的抗Tα1抗体有促进作用。ELISA是将抗原、抗体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合的实验技术，具有特异性强,灵敏度高的优点,在适宜条件下,能准确测定血清抗体效价。由于所制备的抗体与BSA偶联,因此,在包被液和一、二抗抗体稀释液中不应包含BSA,本试验用浓度为5%的脱脂奶粉作封闭,达到较好的效果。本实验为检测Tα1表达产物提供了灵敏度高,特异性强的抗体,为Tα1的分离纯化及大规模生产，从而为进一步满足临床需要奠定了基础。

胸腺素a1抗体的制备及其效价测定

2　结果