植物细胞大规模培养技术

植物细胞培养技术就是为了某种目的而在细胞水平上对离体植物细胞或原生质体进行的一系列生物工艺学操作。它包括分离、培养、再生以及一系列相关的操作。就有用化合物的生产来说，它主要是指在无菌条件下通过培养植物细胞生产有用化合物的过程。

一、植物细胞培养的特性

（1）植物细胞较微生物细胞大得多，有纤维素细胞壁．细胞耐拉不耐扭，抵抗剪切力差

（2）培养过程生长速度缓慢，易受微生物污染，需用抗生素；

（3）细胞生长的中期及对数期．易凝聚为直径达350JJm一400Pm的团块，悬浮培养较难；

（4）培养时需供氧，培养液粘度大：

（5）具有群体效应；

（6） 因为有细胞壁, 培养细胞产物滞留于细胞内，产量较低；

（7）细胞培养过程有结构与功能全能性,因而易分化,从而导致目的产物低于原植物体内浓度；

（8） 悬浮培养中要求有一定的细胞浓度，否则不生长（25000~50000个/ML）。

二、植物细胞培养需要解决的问题

（1）氧和二氧化碳的控制，过多氧过少氧均不利于生长；

（2）营养物的供应；

（3）细胞密度过高引起细胞团聚甚至分化

（4）培养过程中细胞的分化的防止，

（5）细胞取得中微生物的去除；

（6）细胞壁脆性的存在要求培养体系剪切力要小；

三、培养系统

1、悬浮培养系统

A、械搅拌式培养系统

机械搅拌式生物反应器通常是根据植物细胞的特性在微生物发酵罐的基础上作如下改进：

（1）搅拌装置要减少剪切，一般改叶轮式为螺旋式

（2）因为植物细胞生长周期长，需要随时补充水分和营养，因此必须设计加液装置；

（3）由于植物细胞的生理活动需要新鲜空气，且细胞代谢也可能产生有害气体，所以必须设计通气装置；

（4）便于取样观察，一般还设计有取样口。

B、气压搅拌式培养系统

考虑到机械搅拌式反应器的剪切作用难以避免，同时搅拌器转动的中轴往往是容易使培养物污染的部位，因此，发展出空气提升式生物反应器，但其缺点是搅拌不均匀。

C、旋转式培养系统

一般用于产品中试或某些必需裂解细胞才能获得目的产物的培养，其优点是控制精确，处理灵活，缺点是培养体积较小。

2、固定化培养系统

在许多愈伤组织和悬浮培养体系中,发现母体植物的细胞不产生次级代谢产物。但是,当发生分化,芽/根或植物胚胎器官组织均可开始分化生产同样的次级代谢产物。

细胞固定化培养技术按照其支持物不同可以分为两大类：

包埋式固定化培养系统：支持物多采用琼脂、琼脂糖、藻酸盐b、聚丙烯酰胺等；

附着式固定化培养系统：支持物采用尼龙网、聚氨酯泡沫、中空纤维等材料。

（1） 平床培养系统。

本系统由培养、液罐和动泵等构成。新鲜的细胞被固定在床底部由聚屏烯等材料编织成的无菌平垫上。无菌液罐被紧固定在培养床的上方，通过管道向下滴注培养液。培养床上的营养液再通过动泵循环送回中，本系统设备较简单，比悬浮培养体系能更有效地合成次生物质。不过它占地面积大，累积次生代谢物较多的滴液区所占比例不高；而且在这密封的体系中氧气的供应时常成为限制因子，经常还得附加提供无菌空气的设备。

（2）立柱培养系统

本方法将植物细胞与琼脂或褐藻酸钠混合，制成一个个1-2 cm3的细胞团块，并将它们集中于无菌立柱中。这样，下滴的营养液流经大部分细胞，亦即"滴液区"比例大大提高，次生物质的合成大为增强，同时占地面积大为减小。

这一技术的优点在于：

细胞位置的固定使其所处的环境类似于在植物体中所处的状态，相互间接触密切，可以形成一定的理化梯度，有利于次生产物的合成；

由于细胞固定在支持物上，培养基可以不断更换，可以从培养基中提取产物，免除了培养基中因含有过多的初生产物对细胞代谢的反馈抑制，也由于细胞留在反应器中，新的培养基可以再次利用这些细胞生产初生产物，从而节省了生产细胞所付出的时间和费用；

正是由于细胞固定在一定的介质中，并可以从培养基中不断提取产物，因此，它可以进行连续生产。可以较容易地控制培养系统的理化环境，从而可以研究特定的代谢途径，并便于调节。

植物细胞固定化培养时必须考虑以下几个问题：

① 所选用的植物细胞的次生代谢产物的产量是否很高，细胞生长速度是否较慢并能维持较长时间的生活能力；

② 所选用的固定支持物对细胞的存活是否有影响，对产物的合成是否有阻碍；

③ 终产物是否能释放到培养基中，如果产物不释放到培养基中，是否能采用物理（电击）或化学（离子渗透法）方法使其释放而又不影响细胞生活力。

四、植物细胞规模培养技术要点

1.细胞系的建立和选择

2.优良细胞系的增殖培养

3.大规模培养体系的建立

一步法逐级放大：对于细胞生长与目的产物合成同步的类型，一般采用此方法建立大规模培养系统。

两步法：用于目的产物合成在细胞生长发育到一定时期进行，细胞生长和产物合成需要不同的培养基的类型。先在细胞生长培养基中培养大批量细胞，当细胞生长至合成产物的阶段后，再将其转入到产物合成培养基中培养。

如果采用固相培养方式生产次生产物，一般均需采用两步法建立体系。

五．植物细胞规模化培养中的有关工程技术问题

1．悬浮培养系统必须适应植物细胞特性

2．植物细胞培养液的流变特性

3．植物细胞培养过程中的气体调节

4．泡沫和表面粘附性

5、剪切力对植物细胞的影响