慧德易教您如何选择色谱柱的保护柱

怎样选择色谱柱的保护柱，但又不影响分离分析?这是色谱工作者经常提出的一个问题。通常，在选择保护柱之前首先要考虑的是样品是否清洁。对于大部分分析工作者来说，一支lcm长的保护柱便能提供对柱子的保护，工作中发现要经常更换1cm的保护柱，那么应选择2cm或3cm长的保护柱。保护柱越长，自然所装填的色谱填料越多，则其越能避免污染物进入分析色谱柱的机会。当然，随着保护柱的长度加长，样品的保留时间会比使用短保护柱长。

一般来说，保护柱的内径与分析色谱柱的内径相同或相当即可。

保护柱的填料装填方式也很重要。目前有薄膜装填法的保护柱，使用过程很简单方便，而且可以在实验室中进行干装。但是，其最大的缺点是不经济，特别是针对中国的具体情况，一次性使用相对费用较高。另外，薄膜装填法的保扩性所装填的色谱填料有限，只能提供很有限的保护作用；不过也因为所装填的色谱填料较少，保护柱的长度也较短，所以对分析样品的保留时间的影响也很小。

另一种保护柱结构其实质是缩短了的色谱分析柱，设计方式上有直连式、手紧式或整体式。整体式设计是由色谱柱的生产厂商直接安装在色谱分析柱上的，必须与色谱分析柱一同订货，可以非常方便地使用，但不能够被修改。直连式结构设计可在任何时候由色谱工作者来安装连接，可以与任何品牌的色谱分析柱连接使用，而且还可以根据样品的相关情况选择不同的保护柱一样，只是在连接时不需要借助扳手等工具，直接用手上紧即可。另外从保护柱结构的角度看，保护柱的结构又分为是否可以更换保护柱柱芯。现在大多数的保护柱均可以更换保护柱柱芯，可以降低保护柱的使用成本。大多数人是根据色谱分析柱的填料选择保护柱的填料，正常情况下可以选择与分析色谱柱一样的色谱填料。但是，根据实际的分析工作，也可不必与分析色谱柱的填料完全相匹配。

对于选择保护柱的原则是：在满足分析分离要求的前提条件下，尽可能地选择较短的保护柱结构，尽可能选择对分离样品小一些保留性的填料。

六、故障与解决的方法

选样了一根好的柱子，再加上有效的维护与预防，可以避免不少意外故障的发生。当然谁也不能保护色谱柱“永远”不出故障，任何一根色谱柱最终都会因为柱效下降直到报废。柱损坏的标志是：①塔板数下降；②峰形改变；③压力增加；④保留时间变化。有时往往是几种情况伴随着同时发生。

1、塔板数下降

在色谱柱使用过程中，塔板数会不断下降．一般情况下，进2000个样品后柱效N值要降低50％，（但也不能一概而论），而用C₁₈，柱梯度分析氨基酸，进100个血清样品之后，柱效就下降50%。这两种情况的差别之所以这么大，关键在于处理样品的方法不同。

如果柱效很快下降，应考虑上节所提到的人为不利因素。N值突然下降（如一个工作日内），应考虑柱头塌陷或进了不合格的样品。如果使用了不同系统的色谱柱造成柱效下降，是某系统中存在柱外效应。新建立的方法中柱效下降，可能是样品和其它内在因素引起，此时要采取相应措施，防止继续给柱造成危害。

2、峰形变坏

出现拖尾峰、分叉峰或非高斯峰的原因很多，但总是与塔板数骤然下降联系在一起的。峰形变坏而保留时间不变，多半是柱受到阻塞（不锈钢烧结片），或者柱头有了空穴。

3、压力增加

和柱塔板数不断减少一样，在使用过程中柱压慢慢增加，可视为正常。如果压力一下子增加过高，应考虑两种可能，一是样品沉积在柱内，二是柱内硬件阻塞（未考虑系统其它部分的阻塞）。

对于第一种情况，要用能溶解所用样品的溶剂冲洗。冲洗时拆开柱与检测器之间接头，正向冲洗或将柱出口接在泵上反向冲洗（如果柱条件许可），使用大约30～50mL溶剂。不要让冲洗液通过检测器流动池，以防污染。在冲洗过程中不断检查，直到压力恢复正常为止。如冲洗无效，应该考虑是第二种情况，先换烧结不锈钢过滤片，拆下柱，拧开柱头上的压帽，持垂直方向小心取出不锈钢过滤片，换上新的（不是洗过的旧滤片）。换滤片时尽量不要搅动柱头填料，如有塌陷，可用同种填料中乙醇调成糊状补平柱头，压紧，压平，柱性能可恢复如前。如果柱头填料己脏，可挖去2～3mm，用新填料补平。

4、保留时间的改变

保留时间的变化指两种类型的情况，第一种是同一根柱样品间的保留变化，第二种类型主要是填料的差异造成的，许多实验都会碰到，现讨论如下。

不同牌号的色谱柱分离的色谱峰保留时间可在小范围内移动，但峰的顺序和分辨率不变，可改变流速或溶剂强度（反相色谱加水调节）进行校正。如果谱图中色谱顺序发生了变化，或者两峰重叠在一起，问题就比较严重。保留时间发生大的变化，主要由柱填料硅酸相互作用所致，另外有次级保留因素的影响。硅胶为基质的填料表面含有硅醇，有的封尾填料可部分去掉硅醇、不封尾填料的硅胶表面硅醇基更多。酸性或碱性分子可与硅醇发生不同程度的相互作用。硅酸与样品分子作用的强弱，因不同批号的硅胶和不键合相填料而异。即使同批号的硅胶而不同批号的键合相也有差异。硅醇对阳离子或碱性样品影响最大。参照下列要求做可以减少色谱柱之间保留时间的变化。

（1）仅用同一厂商的柱。实际上不具可操作性，但最起码作某一专门分析方法时要用同一厂商的柱。

（2）设计分离条件，使保留值变化最小（建立标准的方法）。

（3）选用液相色谱系统或色谱柱对次级保留因素（外界）灵敏度最低。

（4）换新柱时调整分析条件保持旧柱的保留值（改变条件）。这一步工作是必不可少的，在长期的常规分析中，不会从头至尾用一根柱，中间总要换新柱，每换一次，都应仔细地调整各组分的保留。

在实际工作中，应考虑到可能会发生什么问题，怎样预防这些问题的发生。

第一，前面提到的作某一专门分析尽量用同一批号的柱。也可与厂商接洽，提出特殊的要求。

第二，选择硅醇影响最小的分离条件，减少柱间的差异。如在流动相中添加三乙胺抑制硅醇的作用。

第三，许多色谱工作者认为，在流动相中加入离子对试剂更能抗硅醇的干扰，使保留具有更好的重复性。

不管什么情况下引起保留值的明显变化，都应该改善分离条件。

改善特别差的峰的分离度，并使保留值稳定下来。例如用梯度洗脱分析体液中的氨基酸，这种复杂的样品有20多个组分，保留稍有变化可能对分离就产生灾难性的结果。一些极端组分，如偏向酸性或碱性的组分很易发生保留值的改变，应用不同流动相的组成、pH值和缓冲液的浓度，可以改善关键色谱峰间的分离。色谱峰分离度变差，可能会系统地改变保留值。

塔板数降低、压力增高、峰形变差、保留值变化可能同时发生，可能都是由柱引起的。下表的内容可帮助找到一些故障的原因，有些内容将在后面的章节中详细讨论。

表11-1 由柱引起的故障

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