一、实验要求：

1、掌握从土壤中提取微生物的实验原理。

2、掌握倒平板的技术和分离纯化大肠杆菌的基本操作技术。

3、能通过后续实验对目的菌做出简单生化鉴定。

二、实验目的：从土壤中分离提取大肠杆菌。

三、实验背景：

1、大肠杆菌生物学分类：细菌域，变形菌门，γ-变形菌纲，肠杆菌目，肠杆菌科，埃希氏菌属，大肠杆菌种

2、大肠杆菌形态特征：革兰氏阴性短杆菌，大小0.5×1～3微米。周身鞭毛，能运动，无芽孢。能发酵多种糖类产酸、产气，兼性厌氧菌。该菌在自然界的水中可存活数周至数月，在温度较低的粪便中存活更久。胆盐、煌绿等对大肠杆菌有抑制作用。对磺胺类、链霉素、氯霉素等敏感，但易耐药，是由带有R因子的质粒转移而获得的。

四、器材与试剂：

①土铲、盛9m1无菌水的试管、三角烧瓶、盛100m1无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶、无菌玻璃涂棒、无菌吸管、接种环、酒精灯、火柴、无菌培养皿、显微镜、载玻片、盖玻片、量筒、吸水纸、烧杯、电炉、石棉网、镊子、恒温培养箱、生化培养箱 高温灭菌锅、电子天平、天平、pH试纸、擦镜纸、棉花、纱布、报纸、试管架、试管夹、标签、记号笔、放大镜、载物盘等。②蒸馏水、牛肉膏、蛋白胨、氯化钠、琼脂 、K2HPO4、NaCl、乳糖、2%伊红Y溶液、0.35%美蓝溶液、柠檬酸铁铵、Na2S2O3·5H2O（硫代硫酸钠）、3%～10%过氧化氢、香柏油、草酸铵结晶紫染液、革兰氏碘液、95%乙醇、番红染液

五、实验内容：

1、制作牛肉膏蛋白胨培养基、伊红美蓝培养基。

2、对培养基、滴管、试管、玻璃棒等器材进行高温灭菌处理。

3、用稀释法从土壤中分离细菌。

4、将样品接种到伊红美蓝平板上进行分离。

5、观察外部特征、镜检，将疑似大肠杆菌菌种接种到牛肉膏蛋白胨斜面上，进行扩大培养。

6、对菌种进行生化反应并简单鉴定。

六、实验步骤：

1、培养基的配制

①牛肉膏蛋白胨培养基

配方：牛肉膏（1克）；蛋白胨（2克）；氯化钠（1克 ）；琼脂 （4克 ）；水（200毫升）

方法：在烧杯内加水100毫升，放入牛肉膏、蛋白胨和氯化钠，用蜡笔在烧杯外作上记号后，放在火上加热。待烧杯内各组分溶解后，加入琼脂，不断搅拌以免粘底。等琼脂完全溶解后补足失水，用10%盐酸或10%的氢氧化钠调整pH值到7.2～7.6,分装在各个试管里，加棉花塞，制斜面。

②伊红美蓝培养基

配方：乳糖 （2克），蛋白胨 （2克），NaCl（1克），K2HPO4（1克），2%伊红水溶液 （4毫升），0.35%美蓝水溶液 （4毫升），琼脂 （4克），水 （200毫升），pH 7.1 注：先调PH，灭菌在加乳糖、伊红、美蓝

方法：先配200毫升蛋白胨水琼脂培养基加热溶化，冷却至60℃左右时，再把已灭菌的乳糖溶液、伊红水溶液及美蓝水溶液按上述量以无菌操作加入。摇匀后，立即倒平板（见第三步）。乳糖在高温灭菌易被破坏必须严格控制灭菌温度，一般是0．70kg/cm2　（10磅/英寸2　），115．2℃灭菌20分钟。

③柠檬酸铁铵半固体培养基。（用于生化反应中H2S试验）

配方：蛋白胨 （2克），NaCl （1克），柠檬酸铁铵 （0.1克），硫代硫酸钠 （0.1克），琼脂 （1.2克），蒸馏水 （200毫升），PH 7.6

2、将所需器材高温灭菌，备用。

3、倒平板 ：需要倒三皿，防止失败可多做几皿。其方法是右手持盛伊红美蓝培养基的试管或三角烧瓶，置火焰旁边，左手拿平皿并松动试管塞或瓶塞，用手掌边缘和小指、无名指夹住拔出，如果试管内或三角烧瓶内的培养基一次可用完，则管塞或瓶塞不必夹在手指中。试管（瓶）口在火焰上灭菌，然后左手将培养皿盖在火焰附近打开一缝，迅速倒入培养基约15ml，加盖后轻轻摇动培养皿，使培养基均匀分布，平置于桌面上，待凝后即成平板。也可将平皿放在火焰附近的桌面上，用左手的食指和中指夹住管塞并打开培养皿，再注入培养基，摇匀后制成平板。分别标号10-4、10-5、10-6。

4、土壤稀释液的制备：在沈阳大学4号楼门前树林内选取土样，称取土壤1g，放入99mL无菌水的三角瓶中，振荡10min，即为稀释10－2的土壤悬液。另取装有9mL无菌水试管4支，用记号笔编上10－3、10－4、10－5、10－6。取已稀释成10－2的土壤液，振荡后静止0.5min，用无菌吸管吸取1mL土壤悬液加入10－3的无菌水的试管中，并在试管内轻轻吹吸数次，使之充分混匀，即成10－3土壤稀释液。同法依次连续稀释至10－4 ，10－5，10－6土壤稀释液。在土壤稀释过程中，应用一支吸管由浓到稀，稀释到底。

5、涂布接种：稀释完毕后，可用原来的移液管，从菌液浓度最小的10-6的稀释液开始吸取1ml 10-6稀释液，加到相应编号10-6的无菌培养皿内，以相同方法分别吸取1ml10-5、10-4的稀释液加到相应编号为10-5、10-4的无菌培养皿内。用无菌玻璃涂棒在培养基表面轻轻地涂布均匀。37℃恒温箱培养48小时。

6、观察初检：三种菌种浓度的培养皿中均会出现大肠杆菌菌落，寻找菌落中心呈暗蓝黑色，发金属光泽的菌种。并进行镜检, 观察。

7、扩大培养：将疑似菌落接种于斜面培养基上，进行扩大培养。37℃培养48小时。

8、生化鉴定：

①革兰氏染色：经革兰氏染色可见革兰氏阴性的短杆菌, 两端钝圆。散在或成对存在；

②硫化氢试验：用柠檬酸铁铵半固体培养基接种待检菌种；

③过氧化氢试验。

9、观察实验结果，并记录，整理器材。