蛋白质很少“单打独斗”，信号转导、基因转录、代谢调控等大部分生命活动都依赖于蛋白质相互作用（Protein-Protein Interactions, PPI）。我们在进行机制探索、通路验证、靶点确认、药物筛选时，遇到过这些困惑吗？

想验证两个蛋白是否互作，应该做Co-IP还是Pull-down？

想看活细胞内动态互作，是不是要做FRET、BRET或NanoBiT？

想研究信号通路，用IP-MS还是TurboID/BioID？

想证明“直接结合”并测亲和力，应该选SPR、BLI、MST或ITC？

问题不是“有没有办法”，而是“方法太多不知道选哪个”。Co-IP、Pull-down、FRET、SPR、BLI、IP-MS……这些技术都能研究“蛋白互作”，但解决的问题不同。Co-IP阳性并不能直接证明两个蛋白存在直接结合，FRET也不能简单等同于形成稳定复合物，SPR回答的是另一层面的结合亲和力问题。因此，选择蛋白互作技术之前，首先需要明确：究竟想获得哪一层证据？

然而，许多科研人员在设计课题时，常陷入技术选型的误区：耗费数月做Co-IP却因结合较弱导致阳性信号缺失；或者在酵母双杂交（Y2H）中筛出一堆克隆，后期验证时却发现大多是假阳性。选错技术，不仅浪费宝贵的样品与试剂，更容易耽误课题进度。成熟的蛋白互作研究必须——技术组合+多层验证。

一、选择之前，

先问清楚4个问题

1.1确定研究的核心问题是什么？

比如是否存在互作、是否直接结合、结合强弱、互作是否发生在活细胞内、是否受刺激调控、是否需要对整个互作体系进行研究？

1.2确定研究的样本类型是什么？

细胞裂解液、纯化的重组蛋白、活细胞、组织样本、体内样本……

1.3确定研究对象的有哪些特点？

互作是否较弱或瞬时、是否依赖翻译后修饰、是否属于膜蛋白、是否存在多亚基复合物？

1.4确定想要得到哪类数据？

定性、定量还是定位？动力学或亲和力数据？互作信号通路或互作区域、关键位点、调控条件等机制信息？

二、一张表了解10种蛋白互作技术

三、10种技术分别适合哪些场景？

3.1免疫共沉淀（Co-IP）：验证体内天然互作

Co-IP是研究体内蛋白互作的经典方法，用于确定两种蛋白质在完整细胞内的相互作用。实验采用非变性温和裂解液，在保留细胞内天然蛋白质复合物结构的前提下，用靶蛋白抗体“钓”出复合物。用Protein A/G磁珠捕获抗体-蛋白复合物，反复洗涤去除杂蛋白。洗脱复合物后，通过WB检测已知互作蛋白或用质谱鉴定未知互作蛋白。

Co-IP在接近生理条件的环境下进行，能够保留天然构象及辅助亚基，适用于验证生理状态下的蛋白互作，还能排除过表达造成的假阳性。Co-IP还可检测依赖于修饰的蛋白互作，以及检测多个潜在互作“搭子”。Co-IP阴性不一定代表不存在互作，阳性也不能证明直接结合，无法排除通过第三方蛋白形成的间接结合。如果需要进一步区分，则需要进行体外重组实验（如GST pull-down）进行验证。

半定量Co-IP实验技术操作流程

（源自文献：https://doi.org/10.1016/j.xpro.2021.100644）

3.2Pull-down：体外验证直接结合

Pull-down是体外验证蛋白质相互作用的经典技术，核心是将带有GST、His、Strep等标签的诱饵蛋白固定于固相亲和载体，与纯化蛋白或细胞裂解液共同孵育以捕获结合蛋白，经洗涤去除非特异性结合后，通过SDS-PAGE、免疫印迹或质谱分析鉴定互作关系。

Pull-down体系条件可控，可调控缓冲液组成、离子强度与辅因子，既能验证蛋白二元直接互作、排除细胞内间接桥接干扰，也可用于筛选未知结合蛋白、定位蛋白互作结构域。但体外重组蛋白易出现折叠、聚集异常，且缺乏翻译后修饰，可能遗漏PTM依赖型互作，可通过加入ATP、Mg2+等辅因子或采用哺乳动物表达系统优化。

GST Pull-down实验体系及质谱、WB验证结果

（源自文献：https://doi.org/10.1371/journal.pone.0265692）

3.3 SPR：定量检测结合与解离速率

表面等离子共振（SPR）是无标记、实时的生物分子互作定量检测技术。其原理为将诱饵蛋白固定于金膜芯片表面，待测分子流经时发生结合会引起芯片表面折射率改变，通过共振角位移实时记录结合-解离动态曲线，可精确计算平衡解离常数KD、结合速率kon、解离速率koff等动力学参数。

该技术无需荧光或同位素标记，灵敏度可达μM至nM级，适用于蛋白-蛋白、蛋白-核酸、蛋白-小分子互作分析及药物靶点筛选。但该技术对样品纯度要求高，检测成本高、通量较低，更适合关键互作的定量验证而非大规模初筛。

3.4 BLI：并行高通量分析

生物膜干涉技术（BLI）是一种无标记、光学生物传感技术，实时定量分析生物分子相互作用的结合强度与动力学。其原理是将配体固定于光纤探头末端的生物传感器表面，浸入样品后，蛋白互作结合引起传感器表面的干涉光谱发生位移，实时监测结合过程。

BLI抗杂质干扰能力强，血清、培养基等粗样本可直接检测。检测通量更高，可并行检测多个样本与浓度梯度，样品消耗量低于SPR，适用于抗体筛选、蛋白突变体亲和力比较、中高通量药物筛选等场景。实验需摸索蛋白固定化条件，同时需注意蛋白聚集、多价结合等因素会干扰结果准确性。

3.5 MST：少量样品也能测亲和力

微量热泳动（MST）基于温度梯度场中分子热泳泳动效应。其原理为对靶蛋白进行荧光标记，通过红外激光在毛细管内建立微尺度温度梯度，分子因尺寸、电荷及水合层特性差异呈现不同热泳速率；配体与靶蛋白结合形成复合物后，上述性质改变引发热泳信号偏移，通过浓度梯度滴定拟合曲线，即可计算解离常数Kd、结合化学计量比及热力学参数，定量表征两个蛋白之间的亲和力强弱。

该技术在均相溶液中检测，样本消耗量低，适合蛋白样品量有限的研究。但不同体系信号窗口差异较大，荧光标记、缓冲液成分、蛋白聚集及非特异吸附均会影响结果，需结合体系优化条件。

3.6 Y2H：筛选潜在的互作蛋白

酵母双杂交（Y2H）是经典的体内遗传学蛋白互作筛选技术，基于转录因子功能重构原理：将诱饵蛋白与转录因子DNA结合域（BD）融合，猎物蛋白与转录激活域（AD）融合，两蛋白互作则使BD与AD空间靠近，重构完整转录因子，驱动HIS3、LacZ等报告基因表达，通过营养缺陷筛选或显色反应检测互作。

Y2H可检测微弱、瞬时互作，还可进行全基因组筛选，一次性筛查数千至数万个潜在互作蛋白。实验在活细胞内进行，无需纯化蛋白。存在假阳性风险，常与Co-IP联用。

3.7 FRET：观察活细胞中的互作

荧光共振能量转移（FRET）在供体和受体荧光团距离足够近（＜10nm）时，供体受激发后将能量转移至受体，受体发光，通过检测发射光谱变化判断是否互作。FRET可实时追踪活细胞内蛋白互作的时空变化，明确互作的亚细胞定位，适用于信号传导、蛋白转运、构象变化等动态过程研究。

3.8 NanoBiT：实时监测活细胞互作变化

NanoBiT属于分裂荧光素酶互补技术，将NanoLuc荧光素酶裂解为一个大片段（LgBiT）和一个小的高亲和力肽（HiBiT）。蛋白互作时两个亚基重构，恢复荧光素酶活性并产生发光信号，能够以最小的扰动实现蛋白质的灵活标记和定量。

NanoBiT技术不需要外源激发光，背景信号较低、灵敏度高，适合监测配体、药物或信号刺激引起的微弱或瞬时互作，用于活细胞或生物体内蛋白互作的实时检测。检测操作简单、信号稳定，适合96/384孔板的高通量筛选格式。

3.9 ITC：进一步回答为什么结合

等温滴定量热法（ITC）在恒定温度下直接测量复合物形成过程中的热量变化，通过测量互作时吸收或放出的热量，拟合计算得到解离常数、自由能等参数。实验过程无需固定化修饰，蛋白在接近生理状态的溶液中反应，样品不会遭到破坏可回收继续实验。但需要毫克级高纯度的蛋白，样品消耗量较大。对亲和力过高或焓变小的互作检测灵敏度有限，常与SPR、BLI技术联用。

3.10 AP-MS/IP-MS：全景解析互作网络

这是亲和纯化或免疫沉淀与质谱联用的蛋白互作网络分析技术，通过免疫沉淀或标签亲和纯化富集诱饵蛋白及其结合复合物，经胰酶消化后通过液相色谱-串联质谱鉴定，可一次性获得数十至数百个候选互作蛋白。实验保留蛋白质的天然修饰与胞内互作环境，结合GO、KEGG等数据库可系统解析互作网络、挖掘新调控机制。但存在假阳性风险，高丰度蛋白、非特异吸附、过表达易干扰结果。需设置IgG、空白微珠等对照，候选蛋白需用一对一Co-IP或其他方法二次验证。

四、到底怎么选？按实验需求匹配技术

4.1根据实验目的选

· 探索新机制：优先选择IP-MS。

· 验证已知假设：Co-IP与Pull-down的组合。

· 回答动力学机制：选择SPR、BLI或MST。

4.2评估蛋白性质

· 难溶蛋白/膜蛋白：建议采用临近标记或酵母双杂交。

· 依赖翻译后修饰（如磷酸化、泛素化）：优先选择Co-IP。

4.3建立完整数据闭环

高水平研究往往不依赖单一技术，而是构建多维度互补的证据链：

· 预测/筛选：Y2H或IP-MS 筛选。

· 体内结合：Co-IP。

· 体外结合：GST Pull-down。

· 定位与突变：荧光共定位、FRET、Cryo-EM。

· 互作强度：SPR、BLI

标准组合通常：Co-IP（体内）+Pull-down（体外）+SPR/BLI（定量）。