明明我们获得了一张颜色鲜明、共定位清晰、信噪比低的多重免疫组化（mIHC）图片，却担心老板或审稿人提出这些问题：

“你确定这个弱信号是特异性结合，不是荧光染料的非特异性沉淀？”

“这两个标记物高度重叠，是真实的共表达吗，还是光谱拆分不完全引起的串扰？”

“经过这么多轮的热修复，你怎么确定蛋白的抗原活性没有发生改变？与传统的单色IHC结果一致吗？”

想要让回答具有说服力，必须有严谨的对照实验数据。一套实用的对照体系能够解决抗体特异性、荧光信号独立性、单标进入Panel后的准确性、不同通道的串扰现象以及广谱拆分的标准性。

接下来我们将主要讨论福尔马林-石蜡（FFPE）组织中常见序贯HRP-TSA型多重免疫组化（mIHC/mIF）技术如何设置对照实验。

一、生物学对照：证明抗体认对了“对象”

这组对照是为了回答组织中的靶蛋白是否真的存在及其亚细胞定位是否符合预期，有助于优化染色条件，比如抗体浓度、孵育时间等。

阳性对照选择已知高表达靶蛋白的样本进行验证，结果出现符合已知组织学分布和亚细胞定位的信号，说明抗体识别能力没有问题，同时实验流程操作成功。

阴性对照样本优先选择经验证不表达靶蛋白的组织、细胞系或基因敲除材料。其目的是检验阳性结果的真实性，确认染色结果的特异性，排除非特异性结合和背景染色。

一抗空白对照主要是为了排除二抗的非特异性结合以及验证TSA荧光素是否存在非特异性物理吸附或过度沉淀。选用与实验组相同的连续切片，在某轮（或全部）染色循环中，用PBS或封闭液替代一抗，后续的HRP二抗孵育、TSA荧光底物孵育及热剥离步骤保持一致。

一抗空白对照还可以延伸为轮间洗脱桥接对照，用于验证上一轮一抗的洗脱效率（即有无残留），标准的操作如下：

• 完成第N轮TSA显色、抗体洗脱操作后，用PBS洗涤3次，每次5min；

• 不加入第N+1轮的靶点一抗，仅用抗体稀释液或封闭液覆盖组织，按照一抗孵育条件进行处理；

• 加入HRP标记的二抗，室温孵育30-60min，PBS洗涤3次；

• 加入第N+1轮对应的TSA荧光素工作液，正常显色5-10min，PBS洗涤3次；

• 切换至第N+1轮对应的荧光通道成像，观察信号强度。

二、每支抗体要先过“单标关”

单标对照分为传统IHC/IF对照和TSA对照，在TSA系统中只需做TSA单标对照。准备与Panel抗体数量一致的单染切片，比如8色Panel需要8张。每张切片只需要加入1种一抗，进行后续的二抗孵育和对应的TSA荧光染色。单染切片不需要进行DAPI复染，切片应来自与mIHC完全一致的连续切片。

通过单染对照，我们提取每种荧光素在真实组织环境下的波峰与光谱曲线，作为多光谱拆分算法的依据。单染结果与序贯mIHC每一轮的荧光结果进行对比，还能验证Panel组合是否导致抗原屏蔽或相互干扰。

三、Panel组合后需要核对3类干扰

1、单标-多标比较

将每个靶点的单标结果与多重Panel结果在相邻连续切片上比较。重点毕竟组织分布、亚细胞定位、阳性细胞密度、背景和荧光强度的分布是否保持一致。如果某个靶点单标清楚、定位准确，而Panel明显变弱、位置改变或背景升高，则判定Panel不合格，需要重新设计实验。

2、Drop control（逐项撤除对照）

当两个靶点处于同一细胞区室，前一轮大量TSA沉积可能会造成空间位阻，遮挡后一轮的抗体结合，形成umbrella effect（伞效应）。遇到这种情况时，可从完整Panel中撤掉一个抗体-染料组合，其余轮次的操作流程不变，再观察可疑Marker是否恢复或背景消失。通过逐项撤除，定位是哪一轮、哪种染料或哪支抗体产生了干扰。

3、轮次残留

这时需要进行轮间洗脱桥接对照。具体加上文。

四、mIHC画图须知

除了以上的对照设置，我们在投稿前还需要检查一些容易被忽略的细节，比如：

• 在低倍图中标出ROI来源，高倍图保留比例尺，并说明ROI是预设、随机、全切片还是病例需要。

• 同一比较组使用相同曝光、解混参数和显示范围，对亮度、对比度的调整应为线性并统一标准。

• 合并图要至少保留支持核心结论的单通道。

• 图例应写清抗体、荧光、染色轮次和颜色映射。伪彩只是用来辨认，不表示信号的强弱。

• 分割图要同时显示正确案例和困难案例，不能只挑边界清晰的区域。

• 在图注中写清样本数、切片数、ROI数、统计分析等数据。

我们的论文中，提供精彩的实验结果图固然重要，但完善、严谨逻辑闭环的对照更是结论的有力支撑。