表位肽ELISA实验中，再生板的空白本底测试的具体操作步骤是什么？

先说明前提，这个空白本底测试只用来粗略评估再生板，结果合格也预实验摸索条件，不能用于正式表位验证和投稿数据。测试全程同步用一块同品牌酶标板做平行对照，方便对比。

再生处理完成之后，把板内洗脱液全部弃去，用 PBST 充分洗涤数次，轻柔拍干孔内残留液体，不要让孔干透。

步，包被步骤模拟。在再生板和对照板所有孔里加入和正式实验一样的包被缓冲液，不加任何多肽，每孔体积和正式包被保持一致，封板，按照常规包被的温度和时长孵育，一般是四度过夜或者三十七摄氏度两小时。孵育结束后弃去液体，PBST 洗板三次，每次浸泡三分钟，拍干。

第二步，封闭。每孔加入和实验体系相同的封闭液，体积和正式实验一致，封板，按既定封闭温度和时间孵育。结束后弃封闭液，PBST 洗板三次，拍干。

第三步，二抗孵育。加入稀释好的 HRP 标记二抗，稀释比例、稀释液、孵育温度时间都和正式实验完全相同。孵育结束后 PBST 洗板五次，充分拍干，减少游离二抗残留。这里不加一抗，这是本底测试的关键点。

第四步，显色终止。避光加入 TMB 底物，使用和正式实验一致的显色温度与显色时长，时间到之后加入终止液。五分钟之内用酶标仪在四百五十纳米读数，读取每孔 OD 值。

对比数据，再生板所有孔的平均 OD 和新板空白孔平均 OD 接近，差异很小，并且没有个别孔突然出现很高的 OD，说明酶和蛋白残留基本清除。如果再生板平均 OD 明显高于新板，或是孔和孔之间读数差别很大，说明存在残留，这块板不可使用。

还要留意，这个测试只能证明没有明显 HRP 残留，没法证明板面疏水吸附能力已经恢复，就算本底合格，后续还要做对照肽包被测试，才能进一步评估板面吸附多肽的能力。