表位肽ELISA的实验步骤是什么？

适用：间接法表位肽 ELISA（线性表位筛选、单抗 / 血清表位验证）；包被缓冲液：0.05 M 碳酸盐缓冲液 pH9.6；洗涤液 PBST（PBS+0.05% Tween-20）；HRP-TMB 体系，高结合力聚苯乙烯板

1 包被（多肽吸附）

用碳酸盐缓冲液稀释表位肽，常规1–10 μg/mL（多肽差异大，建议棋盘滴定），每孔 100 μL；
封板，4 ℃过夜（推荐），或 37 ℃ 2 h；

疏水肽吸附差、分子量太小：优先用肽 - KLH/BSA 偶联物包被，不要直接包游离短肽，极易假阴性

2 洗板

弃包被液，PBST 200 μL / 孔，洗 3 次，每次浸泡 3–5 min，吸水纸上拍干。

3 封闭

封闭液 200 μL / 孔（1–5% BSA 或脱脂奶，做表位 mapping 优先 BSA，避免奶里杂蛋白干扰）；
封板，37 ℃ 1 h；
洗板，PBST 洗 3 次，拍干。

4 一抗孵育（待检样本）

样本用稀释液（PBST+0.5% BSA）梯度稀释，100 μL / 孔；
样本：杂交瘤上清、纯化单抗、免疫血清；
封板，37 ℃ 1 h，或 4 ℃过夜；
洗板，PBST 洗 3–5 次，拍干。

5 HRP 二抗孵育

按预实验稀释 HRP 标记二抗（抗鼠 / 兔 IgG 等），100 μL / 孔；
封板，37 ℃ 40–60 min；
洗板，PBST 洗 5 次，充分拍干（残留 Tween 会抑制 HRP）。

6 显色

每孔加 TMB 底物 100 μL，避光室温或 37 ℃显色 5–20 min，根据阳性孔颜色深浅及时终止。

7 终止与读数

每孔加 50 μL 2 M H₂SO₄终止（变黄）；5 min 内酶标仪读 A450（参考波长 570/630）PMC

✅ 必须设置的对照（表位肽 ELISA 重中之重）

空白对照：只加稀释液，不加肽、不加一抗

载体对照：包被同等浓度 BSA/KLH（区分抗体识别载体还是肽）

无关肽对照：同长度、同来源无关多肽（排除非特异性肽吸附）

阳性对照：已知能识别该肽的抗体

阴性对照：阴性血清 / 培养基

⚠️ 专属注意点（和普通蛋白 ELISA 不一样）

只能检测线性表位；构象表位抗体这条实验会阴性

多肽容易取向问题：包被后肽的识别位点贴板，即使是真实表位也会假阴性；可尝试 N/C 端加 Cys，偶联后定向固定

多肽溶解度差：避免用 DMSO 终浓度 > 1% 包被，会破坏板吸附

复孔：每个肽、每个样本建议 3 复孔，多肽包被均一性弱于蛋白

可选简化方案（快速初筛）

包被 37 ℃ 2 h → 封闭 37 ℃ 1 h → 一抗 RT 1 h → 二抗 RT 40 min → TMB 显色，适合重叠肽库初筛。