如何避免 RT-PCR 实验中的核酸交叉污染

RT-PCR 核酸交叉污染防控

核酸交叉污染主要来源是之前扩增得到的 PCR 产物，也就是扩增子，其次是高浓度模板样本之间的相互污染，一旦发生会出现假阳性，Ct 值异常偏低。防控核心是物理分区、单向操作、耗材管理、操作习惯、对照监控。

物理分区是最关键的措施，实验区域严格分成三块，独立房间或者超净台分隔。区是试剂配制区，用来分装 PCR 反应 mix、引物，这里不放置任何 RNA、cDNA 和 PCR 产物。第二区是样本处理区，用来提取 RNA、进行逆转录，只接触原始样本和 RNA。第三区是扩增与产物分析区，放置 PCR 仪，扩增完成后的管子只在这个区域开盖。人员移动必须单向，只能从试剂区到样本区再到产物区，不能反向流动，各区专用手套、移液器、枪头盒，器具不能跨区混用。

耗材与移液管控，全部使用带滤芯的无菌无 RNase 枪头，每一次加样都更换枪头，严禁一枪多用。离心管一次性使用，不要重复使用。配体系时，先加缓冲液、水、引物等试剂，再加模板，减少高浓度模板溅出造成污染。不要在扩增区打开 PCR 管盖子，扩增结束后尽量不开盖，避免扩增子气溶胶扩散。

操作习惯上，操作时尽量减少大幅度吹打液体，避免产生气溶胶。离心管开盖动作轻柔，不要快速弹管、剧烈震荡。离心之后短暂快速甩一下管壁液体再开盖。如果有液体溅到管壁或手套上，及时更换手套，台面用核酸去污剂擦拭。实验台面定期清洁，使用含次氯酸钠或者专门的核酸去除剂擦拭，紫外照射只能辅助，不能完全降解扩增子。

试剂管理，试剂提前分装成小体积，避免反复取用母液造成污染。阴性对照必须每板设置，无模板对照 NTC，不加模板只加反应 mix，若 NTC 出现扩增，说明体系或环境存在核酸污染，整板数据作废。同时搭配 NRT 无逆转录对照，用来区分基因组 DNA 污染和 PCR 产物污染。

样本管理，高拷贝样本、阳性样本加样，防止高浓度模板污染其他孔。样本管盖子盖紧再离心，不要把阳性扩增管带到试剂配制区。废弃 PCR 产物密闭收集，妥善处理，不要随意倾倒。

精简版（方案可用）：
为避免 RT-PCR 核酸交叉污染，实验区域按试剂配制、样本处理、扩增产物三区物理分隔，人员单向流动，器具不得跨区使用。全程采用带滤芯枪头，每步换枪头；配制反应体系先加试剂，加入模板。减少液体吹打，避免气溶胶产生；扩增完成后不在扩增区外开盖。定期用核酸清除试剂清洁台面，设置无模板对照监控污染，一旦阴性对照出现扩增，判定存在核酸污染。