如何检测提取的总 RNA 的质量？

RNA 质量主要从三个维度评估：浓度与紫外吸光比值（NanoDrop）、琼脂糖非变性电泳看完整性、仪器测定 RIN 值（生物分析仪）。紫外只能看污染，不能判断降解；电泳看完整性；RIN 是更量化的完整性指标，三者结合起来。

一、NanoDrop 紫外分光光度检测（测浓度 + 杂质污染）

上样 1‑2 μL RNA 样品，用无 RNase 水做空白调零。

A260：用于换算 RNA 浓度RNA 换算系数：1 A260 = 40 μg/mL RNA。

记录样品 RNA 浓度，后续反转录时统一上样 RNA 质量。

A260/A280（蛋白、酚类污染指标）

1.8‑2.1：结果理想；

＜1.8：存在蛋白质或者酚残留；会抑制后续反转录酶活性；

＞2.2：提示 RNA 发生降解。

A260/A230（多糖、盐、胍盐残留指标）

理想值＞1.5；大于 1.8；

＜1.5：胍盐、多糖或者乙醇残留。这类残留会严重抑制反转录和 qPCR 反应，样品尽量不要用于 RT‑qPCR。

⚠️重要提醒：NanoDrop无法分辨完整 RNA 和降解 RNA。就算比值全部合格，RNA 也可能已经降解，必须配合电泳或者 RIN 验证完整性。

二、非变性琼脂糖凝胶电泳，直观看 RNA 完整性（细菌 RNA）

RNA 电泳所有耗材需要除 RNase，电泳缓冲液建议用新鲜配制的 1×TAE，胶为 1% 琼脂糖非变性胶，不要用普通 DNA 胶的旧缓冲液。上样量每孔 500‑800 ng 总 RNA，电压 80‑100V 跑胶。

革兰氏阴性细菌总 RNA 电泳条带特征：

两条最亮主条带：23S rRNA（靠上方）、16S rRNA（靠下方），底部有微弱 5S rRNA 条带。

合格判断标准：

23S 条带亮度大约是 16S 条带的 1.5‑2 倍，条带锐利，弥散拖尾很轻。

如果 23S 明显比 16S 暗，或者整体有大片弥散拖尾，代表 RNA 降解；样品不能用于后续 qPCR；

底部 5S 变强往往也伴随降解；

泳道上沿出现高分子亮带，提示基因组 DNA 残留。

注意：不要使用变性甲醛胶，日常质控非变性胶足够；甲醛胶多用于 Northern blot。

三、Agilent 2100 生物分析仪（Bioanalyzer，RIN 值）

这是 RNA 完整性的准，芯片毛细管电泳。

细菌 RNA 的 RIN 值判定：

RIN＞7：完整性良好，可以做 RT‑qPCR；

RIN 6‑7：轻度降解，谨慎使用；

RIN＜6：降解严重，直接弃用。

补充说明：真核 RIN＞8 更优；细菌 rRNA 降解速度本身更快，RIN＞7 即可接受，不必强求 8 以上。

四、功能层面间接质控（做完反转录之后）

如果已经反转录成 cDNA，可以做一个质控 PCR。

取 cDNA 扩增一个看家基因（如 16S rRNA 基因），同时设置未做 DNase 处理的 RNA 原液作为阴性对照。阴性对照有条带说明还有基因组 DNA 残留，需要重新 DNase 消化。

针对你 lpt 基因 RT‑qPCR 实验的质控取舍建议

最低可行方案：NanoDrop 紫外 + 非变性琼脂糖电泳；

条件允许优先：NanoDrop + Bioanalyzer RIN；质控不合格样品直接舍弃，不要勉强后续 qPCR，否则转录本定量结果完全不可靠。

常见质控失败原因

A260/A230 偏低：Trizol 法沉淀后乙醇洗涤不充分，胍盐残留；

电泳弥散降解：收菌不及时，操作环境 RNase 污染，RNA 反复冻融；

基因组 DNA 残留：Trizol 吸取水相碰中间层，DNase‑I 消化步骤失效。