如何提取总 RNA？

细菌总 RNA 提取（革兰氏阴性菌，适合后续 RT‑qPCR 检测 lpt 基因）

总体思路

细菌 RNA 极易降解，核心要点：全程防 RNase 污染；菌体收集要快速淬灭终止转录；避免基因组 DNA 残留。优先试剂法（Trizol / Trizol‑LS），也可用细菌专用 RNA 提取试剂盒。

样品处理关键点：收菌时刻要立刻冻结或者裂解，不要让菌体继续转录，不然基因转录本丰度会发生偏移，对 lpt 这类必需基因的 qPCR 结果带来误差。

一、试剂与耗材准备

离心管、枪头全部选无 RNase 产品；操作台擦 RNase‑Zap；手套勤换。
试剂：Trizol 试剂，，异丙醇，75% 乙醇（用 DEPC‑水配制），无 RNase 水。
备选：细菌 RNA 提取试剂盒（含溶菌酶裂解体系）。

二、菌体收集（很关键）

摇瓶培养两株菌，生长至目标 OD（对数期，两株菌尽量统一 OD 值）。
取菌液，直接放到预冷离心管，4 ℃，8000 g，2‑3 min 离心收菌体。尽量快速弃上清，不要放置，立刻裂解；也可以液氮速冻沉淀‑80℃暂存，不要反复冻融。

不要室温放置菌体，细菌离开培养基依旧会继续转录、降解 RNA。

三、Trizol 法提取细菌总 RNA 完整操作

菌体沉淀中直接加入 1 mL Trizol。细菌细胞壁需要充分破碎，涡旋震荡 5‑8 min；革兰氏阴性菌震荡一般可以破碎，如果裂解效果偏弱，可以加入少量溶菌酶（终浓度 2 mg/mL，室温 5‑10 min 先处理再加入 Trizol）。充分混匀，室温放置 5 min，让核蛋白复合体充分解离。

加入 200 μL ，盖紧管盖，剧烈颠倒震荡 15 s，室温静置 3 min。

4 ℃，12000 g 离心 15 min。离心之后液体会分成三层：上层水相（含 RNA），中间蛋白层，下层有机相。小心吸取上层水相转移至新无 RNase 离心管，千万不要吸到中间层，中间层有基因组 DNA 污染来源。

加入等体积异丙醇，轻柔颠倒混匀，室温静置 10 min 沉淀 RNA。

4 ℃，12000 g 离心 10 min，管底会出现 RNA 沉淀；弃上清。

加入 1 mL 预冷 75% DEPC 乙醇洗涤沉淀；轻柔颠倒。4 ℃ 7500 g 离心 5 min，弃上清。重复洗涤一次。

短暂瞬时离心，用小枪头尽量吸净残余乙醇。室温开盖晾干沉淀 2‑5 min，不要完全干透，干透 RNA 很难重溶。

加入 30‑50 μL 无 RNase 水，55‑60 ℃水浴 5‑10 min 助溶 RNA。

四、基因组 DNA 去除（必做步骤！qPCR 前）

提取得到的 RNA 里面混有细菌基因组 DNA，会造成 RT‑qPCR 结果虚高。
用 DNase I（RNase‑free）进行消化。按照说明书体系，37 ℃孵育 20‑30 min；之后再进行纯化回收，去除 DNase，得到去除 gDNA 后的总 RNA。

不要省略 DNase 处理，细菌基因组 DNA 残留是 RT‑qPCR 最常见的坑。

五、RNA 质量质控（提取完立刻检测）

NanoDrop 测浓度与 A260/A280 比值：合格区间 1.8‑2.1；低于 1.8 提示蛋白污染；大于 2.2 提示 RNA 降解。A260/A230 大于 1.5，反映没有多糖、酚类残留。

琼脂糖凝胶电泳（1% 非变性 RNA 琼脂糖胶）：完整细菌 RNA 会看到清晰两条主条带 23S、16S，5S 条带比较弱；如果 23S 条带亮度明显弱于 16S，说明 RNA 发生降解，样品废弃不能继续后续反转录。

如果有条件，使用 Bioanalyzer（2100 生物分析仪）得到 RIN 值；细菌 RIN>7 为质量较好。

六、后续保存与注意事项

RNA 分装，‑80 ℃保存；避免反复冻融。尽快反转录合成 cDNA 用于 RT‑qPCR 检测 lpt 基因转录水平。

补充：试剂盒提取

市售细菌 RNA 提取试剂盒操作更简便，自带裂解、柱纯化、DNase 消化步骤；适合新手。依旧要严格控制收菌步骤，快速淬灭菌体。

常见问题

RNA 降解：耗材带 RNase；菌体收集之后室温放置太久；乙醇沉淀后烘干时间过长。

gDNA 污染：吸取水相的时候吸到中间层；没有 DNase I 消化。

RNA 沉淀溶解困难：沉淀过度干透，适当缩短晾干时间，55 ℃水浴助溶。

针对你的 Lpt 转录比较实验：两株菌的收菌 OD、培养温度、裂解提取所有操作条件保持完全一致，后续反转录体系也统一，才可以横向比较 mRNA 的丰度差异。