万古霉素快速检测试剂盒使用说明书

【测定原理】

本试剂盒采用间接竞争ELISA方法，在微孔条上预包被偶联抗原，样本中的残留物万古霉素将和微孔条上预包被的偶联抗原竞争抗万古霉素抗体，加入酶标记物后，用TMB底物显色，样本吸光值与其所含残留物万古霉素的含量成负相关，与标准曲线比较即可得出相应残留物万古霉素的含量。

【试剂盒技术指标】

规格：96孔/盒

灵敏度：1ppb

检测时间：75min

样本检测下限：

组织………………………………………3ppb

牛奶………………………………………40ppb

反应率：

万古霉素……………………………………100%

样本回收率：

组织…………………………………85%±10%

牛奶…………………………………95%±15%

【试剂盒组成】

1、 微量测试孔：1×96孔板（12条×8孔）

2、 标准溶液X6瓶：（1ml/瓶）0ppb、1ppb、3ppb、9ppb、27ppb、81ppb

3、 酶标记物12ml…………………………红色帽

4、 抗体工作液7ml………………………绿色帽

5、 底物A液 7ml………………………棕色帽

6、 底物B液 7ml ……………………黑色帽

7、 终止液7ml ……………………黄色帽

8、 20X浓缩洗涤液40 ml ……………… 白色帽

9、 2X浓缩复溶液50ml ·………………蓝色帽

【所用仪器、试剂】

具备的仪器：酶标仪、均质器、振荡器、离心机、

刻度移液管、天平（感量0.01g）、氮

吹仪、刻度移液管

微量移液器：单道20μl～200μl、单道100μl～

1000μl、多道30～300 μl

试剂：乙腈、正己烷

【样本前处理步骤】

u样本处理前须知

（1）实验中必须使用一次性吸头，吸取不同试

剂时要更换吸头。

（2）实验之前须检查各种实验器具是否干净，

必要时可对实验器具进行清洁，以避免污染干扰实

验结果。

u样本前处理需配制：

配液1、配制1×复溶液：将浓缩复溶液用去离子水按1：1稀释（1份的2×浓缩复溶液+1份去离子水）。

配液2、将40ml浓缩洗涤液（20倍浓缩）用去离子水按照1：19稀释（1份浓缩洗涤液+19份去离子水），或按所需用量配制洗涤液。

u样本处理：

（a）牛奶样本的处理方法

1、 取牛奶1ml，按1:39稀释，混合30s。（50ul牛奶+1950ul配制好的1×复溶液）

2、 取50ul用于分析。

稀释倍数：40

（b）组织高检测限处理方法（检测限0.5ppb）

1、 用均质器均质样本；称取3±0.05g样本于50ml离心管中，加入1g氯化钠，再加入6ml乙腈，用振荡器振荡5分钟；4000转/分以上,室温离心10分钟；

2、 取上清液2ml至干净玻璃试管中，于65℃水浴下氮气/空气吹干；

3、 加入1ml正己烷溶解干燥的残留物，再加1ml配好的1×复溶液强烈振荡混合30s，室温4000r/min以上离心5min。

4、 取50 µl下层相用于分析。

样本稀释倍数：1

【酶标免疫分析程序】

测定前应须知：

1、 使用之前将所有试剂和需用板条的温度回升至室温（20-25℃）。

2、 使用之后立即将所有试剂放回2-8℃。

3、 在ELISA分析中的再现性，很大程度上取决于洗板的一致性，正确的洗板操作是ELISA测定程序中的要点。

4、 在所有恒温孵育过程中，避免光线照射,用盖板膜盖住微孔板。

操作步骤：

1、 从4℃冷藏环境中取出所需试剂，置室温（20-25℃）平衡30min以上，注意每种液体试

剂使用前均须摇匀。

2、 取出需要数量的微孔及框架，将不用的微孔放入自封袋，保存于2-8℃。

3、 配液：将40ml浓缩洗涤液（20倍浓缩）用去离子水按照1：19稀释（1份浓缩洗涤液+19份去离子水），或按所需用量配制洗涤液。

4、 编号：将样本和标准品对应微孔按序编号，每个样本和标准品做2孔平行，并记录标准孔和样本孔所在的位置。

5、 加标准品/样本50µl /孔，然后入抗体工作液50µl/孔。轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板，25℃环境反应30min。

6、 取出将孔内液体甩干，用洗液250µl/孔洗板4-5次，每次间隔15-30秒，用吸水纸拍干（拍干后未被清除的气泡可用干净的枪头刺破）。

7、 每孔加入酶标记物100µl，盖板膜盖板后置25℃环境中反应30min。将孔内液体甩干，用洗涤液充分洗，4-5遍（同上），用吸水纸拍干（拍干后未被清除的气泡可用干净的枪头刺破）。

8、 显色：每孔加入底物A液50ul，再加底物B液50ul，轻轻振荡混匀，25℃环境中避光显色15min。

9、 测定：每孔加入终止液50µl，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于450nm处（建议用双波长450/630nm检测，在5min内读完数据），测定每孔OD值。

【结果判定】

结果判定有两种方法，粗略判定可用第1种方法，定量判定用第2种方法。注意样本吸光值与其所含万古霉素的含量成负相关。

1、粗略判定：

用样本的平均吸光度值与标准值比较即可得出其浓度范围(ng/ml)。假设样本1的吸光度值为0.3，样本2的吸光度值为1.0，标准液吸光度值分别是：0ppb为2.243；1ppb为1.816；3ppb为1.415；9ppb为0.74；27ppb为0.313；81ppb为0.155。则样本1的浓度范围是27ppb-81ppb;样本2的浓度范围是3ppb-9ppb，乘以其对应的稀释倍数即为样本中万古霉素实际浓度。

1、定量分析：

所获得的每个浓度标准溶液和样本吸光度值的平均值（B）除以个标准（0标准）的吸光度值（B₀）再乘以100%，即百分吸光度值。

B—标准溶液或样本溶液的平均吸光度值

B₀—0ng/ml标准溶液的平均吸光度值

以标准品百分吸光率为纵坐标，以万古霉素标准品浓度（ng/ml）的半对数为横坐标，绘制标准曲线图。将样本的百分吸光率代入标准曲线中，从标准曲线上读出样本所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样本中万古霉素实际浓度。

若利用试剂盒专业分析软件进行计算，更便于大量样品的准确、快速分析。

3、标准准曲线：

B/B0 (%)

13 9 27 81

万古霉素(ppb)[µg/kg]

图1：万古霉素检测试剂盒的回归曲线

4、再现性：

%CV

0 1 3 9 27 81

万古霉素(ppb)[µg/kg]

图2：万古霉素检测试剂盒的精密度

由多个不同的实验结果确定了精密度，图2显示出万古霉素检测试剂盒的精密度情况，获得的标准吸收值的变异系数（%CV）对相应万古霉素浓度作曲线，可以看到在全部范围内变异系数如此之低，可以得到很好的再现性。

【注意事项】

1、 使用前将所有试剂温度回升至室温20-25℃。试剂及标本没有回到室温（20-25℃）会导致所有标准的OD值偏低。

2、 在洗板过程中如果出现板孔干燥的情况，则会伴随着出现标准曲线不成线性，重复性不好的现象。所以洗板拍干后应立即进行下一步操作。

3、 混合要均匀，否则会出现重复性不好的现象。

4、 反应终止液为2M硫酸，避免接触皮肤。

5、 不要使用过了有效日期的试剂盒，稀释或搀杂使用会引起灵敏度、OD值的变化。不要交换使用不同批号的盒中试剂。

6、 不用的微孔板放进自封袋密封；标准物质和无色的发色剂对光敏感，因此要避免直接暴露在光线下。

7、 显色液若有任何颜色表明变质，应当弃之。0标准的吸光度值小于0.5个单位（A_450nm< 0.5）时，表示试剂可能变质。

8、 该试剂盒最佳反应温度为25℃，温度过高或过低将导致检测吸光度值和灵敏度发生变化。

【储存】

原包装应储存于2～8℃保鲜冷藏，切勿冷冻。

【有效期】

有效期12个月;生产日期、有效期、生产批号见外包装。