β-内酰胺类抗生素快速检测试剂盒（菌渣）使用说明书

一、检测原理

本试剂盒是利用竞争ELISA方法，在酶标板微孔上预包被抗β-内酰胺类抗生素抗原。检测时，加入标准品或样品溶液，β-内酰胺类抗生素受体和抗体以及酶标记物，包被抗原和加入样本中的β-内酰胺类抗生素药物竞争性地与β-内酰胺类抗生素受体抗体结合后，再与酶标记物形成抗原抗体复合物，用TMB底物显色；加入反应终止液，在450nm波长酶标仪下进行检测，样品中的β-内酰胺类抗生素浓度与吸收光强度成反比。

二、检测范围

本试剂盒是应用ELISA技术研发的药物残留检测产品,与仪器分析技术比较，能经济、快速地检测出畜禽动物组织、蜂蜜、牛奶、饮用水中的β-内酰胺类抗生素残留

三、试试剂盒技术指标

规格：96孔/盒

灵敏度：0.1ppb

检测时间：75min

样本检测下限：

菌渣……………………………………0.1ppm

样本回收率

菌渣…………………………………80%±10%

反应率

β-内酰胺类抗生素………………………………………100%

四、试剂盒组成

1、 微量测试孔：1×96孔板（12条×8孔）

2、 标准溶液X6瓶：（1ml/瓶）0ppb、0.1ppb、0.3ppb、0.9ppb、2.7ppb、8.1ppb

3、 酶标记物7ml………………………红色帽

4、 200×浓缩受体50ul……………………离心管

5、 抗体工作液7ml………………………红色帽

6、 底物A液 7ml………………………棕色帽

7、 底物B液 7ml ……………………黑色帽

8、 终止液7ml ……………………黄色帽

9、 20×浓缩洗涤液40 ml ………………白色帽

10、 10×浓缩复溶液50ml ·………………蓝色帽

11、 盖板膜……………………………………1张

12、 说明书……………………………………1份

【所用仪器、试剂】

具备的仪器：微孔酶标仪、打印机、振荡器、离心机、、天平（感量0.01g）

微量移液器：单道0.5µl-10µl；20µl-200µl，100µl-1000µl、多道250µl

（2）试剂：蒸馏水

【实验前溶液配制】

配液1、1×复溶液：

将10×浓缩复溶液用去离子水以1：9稀释（1份10×浓缩复溶液+9份去离子水），用于样本提取和稀释。

配液2、将40ml浓缩洗涤液（20倍浓缩）用去离子水按照1：19稀释（1份浓缩洗涤液+19份去离子水），或按所需用量配制洗涤液。

配液3、受体工作液的配制：

取5ul的200X浓缩受体，加入1000ul配制好的1×复溶液混匀即可，或按所需用量配制抗体。

【样本前处理步骤】

样本前处理须知

处理任何样本时，都必须注意：

（1）本试剂盒所检测的组织样本包括：动物组织、禽类和水产组织。eg:鸡、鸭、牛、兔、鱼、虾等。

（2）实验中必须使用一次性吸头，在吸取不同的试剂时要更换吸头。

（3）实验之前须检查各种实验器具是否干净，必要时可对实验器具进行清洁，以避免污染干扰实验结果。

（a）菌渣

1、称取1g粉碎样品于10ml离心管中，加入10ml的蒸馏水，充分振荡3分钟，静置5分钟或4000r/min以上速度离心分3分钟。

2、取上层清亮液10µl与1ml的蒸馏水混合即得到待测液。

3、 取50µl进行分析，

注：样本与复溶液混合稀释的量与检测限关系如下：

4、 取50µl进行分析，

【酶联免疫检测步骤】

1、 从4℃冷藏环境中取出所需试剂，置室温（20-25℃）平衡30min以上，注意每种液体试剂使用前均须摇匀。

2、 取出框架及需要数量的微孔，将不用的微孔放入自封袋，保存于2-8℃。

3、 编号：将样本和标准品对应微孔按序编号，每个样本和标准品做2孔平行，并记录标准孔和样本孔所在的位置。

4、 加标准品/样本50µl/孔到各自的微孔中，然后加配制好的受体工作液50µl/孔，用盖板膜封板，轻轻震荡混匀。25℃环境中反应30min。

5、 取出将孔内液体甩干，用洗液250µl /孔，洗板4－5次，每次间隔15-30s，用吸水纸拍干（拍干后未被清除的气泡可用干净的枪头刺破）。

6、 加入抗体工作液50µl/孔到各自的微孔中，然后加酶标抗体50µl/孔，用盖板膜封板，轻轻振荡混匀。25℃环境中反应30min。

7、 取出将孔内液体甩干，用洗液250µl /孔，洗板4－5次，每次间隔15-30s，用吸水纸拍干（拍干后未被清除的气泡可用干净的枪头刺破）。

8、 显色：每孔加入底物液A液50µl，再加B液50µl，轻轻振荡混匀，25℃环境中避光显色10min。

9、 测定：每孔加入终止液50µl，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于450nm处（建议用双波长450/630nm检测，在5min内读完数据），测定每孔OD值。

九、结果分析

结果判定有两种方法，粗略判定可用第1种方法，定量判定用第2种方法。注意样本吸光值与其所含β-内酰胺类抗生素成负相关

1、粗略判定

用样本的平均吸光度值与标准吸光度值比较即可得出其浓度范围(ppb)。假设样本1的吸光度值为0.310， 样本2的吸光度值为0.820，标准液吸光度值分别是：0ppb为1.510；0.1ppb为1.320；0.3ppb为1.030；0.9ppb为0.660；2.7ppb为0.389；8.1ppb为0.198。则样本1的浓度范围是2.7ppb-8.1ppb； 样本2的浓度范围是0.3 ppb-0.9 ppb。乘以其对应的稀释倍数即为样本中β-内酰胺类抗生素实际浓度。

2、定量分析：

所获得的每个浓度标准溶液和样本吸光度值的平均值（B）除以个标准（0标准）的吸光度值（B₀）再乘以100%，即百分吸光度值。

B—标准溶液或样本溶液的平均吸光度值

B₀—0ng/ml标准溶液的平均吸光度值

以标准品百分吸光率为纵坐标，以氨苄β-内酰胺类抗生素啉标准品浓度（ng/ml）的半对数为横坐标，绘制标准曲线图。将样本的百分吸光率代入标准曲线中，从标准曲线上读出样本所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样本中氨苄β-内酰胺类抗生素啉实际浓度。

若利用试剂盒专业分析软件进行计算，更便于大量样品的准确、快速分析。

3、标准曲线

B/B0 (%)

β-内酰胺类抗生素(ppb)[µg/kg]

图1：β-内酰胺类抗生素检测试剂盒的回归曲线

4、再现性

%CV

β-内酰胺类抗生素(ppb)[µg/kg]

图2：β-内酰胺类抗生素检测试剂盒的精密度

由多个不同的实验结果确定了精密度，图2显示出β-内酰胺类抗生素检测试剂盒的精密度情况，获得的标准吸收值的变异系数（%CV）对相应β-内酰胺类抗生素浓度作曲线，可以看到全部范围内变异系数如此之低，可以得到很好的再现性。

十、注意事项

1、 使用前将所有试剂温度回升至室温20-25℃。试剂及标本没有回到室温（20-25℃）会导致所有标准的OD值偏低。

2、 在洗板过程中如果出现板孔干燥的情况，则会伴随着出现标准曲线不成线性，重复性不好的现象。所以洗板拍干后应立即进行下一步操作。

3、 混合要均匀，否则会出现重复性不好的现象。

4、 反应终止液为2M硫酸，避免接触皮肤。

5、 不要使用过了有效日期的试剂盒，稀释或搀杂使用会引起灵敏度、OD值的变化。不要交换使用不同批号的盒中试剂。

6、 不用的微孔板放进自封袋密封；标准物质和无色的发色剂对光敏感，因此要避免直接暴露在光线下。

7、 显色液若有任何颜色表明变质，应当弃之。0标准的吸光度值小于0.5个单位（A_450nm< 0.5）时，表示试剂可能变质。

8、 该试剂盒最佳反应温度为25℃，温度过高或过低将导致检测吸光度值和灵敏度发生变化。

【储存】

原包装应储存于2～8℃保鲜冷藏，切勿冷冻。

【有效期】

有效期12个月;生产日期、有效期、生产批号见外包装。