如何根据目的条带的位置选择合适的分离胶浓度？

先建立一个判断基准，理想的目的条带位置是处于分离胶从胶面到底部大约二分之一到四分之三的区域，这个区间凝胶分子筛的分辨能力，阻滞力度适中。如果目的条带落在这个范围内，代表当前胶浓度基本适配目标蛋白。

当目的条带位置偏上，也就是靠近浓缩胶和分离胶的分界线，说明凝胶孔径偏小，阻力太大，蛋白迁移受阻。下次实验需要降低一档分离胶浓度，更大的胶孔可以降低阻滞效果，让蛋白向下移动到更合适的区域。如果条带仅仅轻微偏上，不用大幅度调整浓度，也可以适当延长电泳时间作为折中方案；但若是条带明显停留在顶端几乎没有下移，必须更换更低浓度的凝胶。

如果目的条带位置过于靠下，接近溴酚蓝指示剂的前沿，意味着凝胶孔径偏大，筛分阻力不足，蛋白迁移速度过快，小分子存在跑出胶外的风险。这种情况下就要提高一档胶浓度，依靠更小的胶孔延缓蛋白迁移，把目的条带控制在胶的中下段。一旦条带已经跑到分离胶最底端甚至丢失信号，说明当前胶浓度过低，必须选用更高浓度的分离胶。

还要结合杂带的相对位置一起判断。如果目的条带和相邻分子量的杂带距离很近、无法分开，即便目的蛋白处在理想区间，也需要微调胶浓度。两者分子量差距小时，适当提高胶浓度可以拉大迁移距离，提升分辨率；如果杂带都是远大于目的蛋白的大分子，则降低胶浓度更利于区分。

同时兼顾特殊蛋白的实际电泳偏移，经过糖基化或者磷酸化修饰的蛋白，实际电泳迁移位置会比理论分子量偏大。观察条带偏上时，不能单纯依照理论 kDa 判断，要以实际发光条带的位置作为调整依据。

多次实验对比时，记录每一个胶浓度对应的条带相对迁移位置，建立自己的参照。优先选择可以将目的条带稳定控制在分离胶中下段，同时条带锐利、杂带能够有效分开的那个浓度。定性实验只要条带保留在胶内即可，若是需要分辨蛋白变体，就严格控制条带落在分离效果的中间区段，以此确定最终使用的分离胶浓度。