1)对于常温运输的细胞，收到细胞后，检查是否有运输问题，即细胞培养瓶或管是否破损，细胞培养液是否溢出。若没有运输问题，请75%酒精消毒后，保留封口膜，放入细胞培养箱中静置。严格检查培养箱的参数：温度，湿度和CO2浓度。细胞静置时间一般为6-12小时后，细胞状态稳定后，即可开始后续操作。选用正确的细胞培养体系，A2780(人卵巢癌细胞)严格按照说明书的培养条件进行培养。条件允许，培养的三天内做细胞拍照记录，通过邮件发送给我们做及时状态跟踪。

2)对于干冰运输的细胞，请取出冷冻管后，须立即放入37C水槽中快速解冻，轻摇冷冻管使其在1分钟内全部融化，并注意水面不可超过冷冻管盖沿，否则易发生污染情形。然后将其复苏培养，次日更换培养液。

注意事项：

1)细胞漂浮：培养瓶不开封，瓶口酒精擦拭后平躺放置在培养箱。次日观察，如细胞大部分又贴回瓶底，表明细胞活力正常，剩余漂浮的细胞可以离心去掉，留10ml培养液培养观察，细胞生长至汇合度80%，进行消化传代；如细胞还是不贴壁，将细胞离心收集转到新培养瓶，原培养瓶加部分培养液继续培养，中间注意观察，我们的技术人员会一直跟踪指导，直到问题解决。

2)对于生长缓慢的贴壁细胞：可采用适当的提高培养基中血清浓度，或隔日换液的方法来细胞的状态和生长速度。

3)对于生长不均的贴壁细胞：在培养过程中若出现细胞分布明显不均时（即某一区域细胞已重叠生长，而旁边则为一块空白），此时可将细胞进行消化，重新打散，贴壁，加入新培养基进行培养。

Operation steps for cell culture

1.吸走多余培养基，加入3-5mL PBS后轻轻晃动培养瓶润洗细胞；

2.吸干净PBS后加入1mL 0.25%胰酶-0.53mM EDTA，轻轻摇晃培养皿使胰酶浸没细胞表面，培养瓶放37度培养箱消化；

（细胞对于消化比较敏感，消化过度会严重影响细胞状态，导致细胞传代死亡漂浮或者传代后不长。细胞消化到细胞间隙变大但未脱落，可以轻轻吹下时即可终止，禁止消化到细胞漂浮。混匀细胞时尽量轻柔，不要吹出大量气泡。）

3.加入6-8ml培养基终止消化，轻轻吹下细胞混匀；

4.将混匀的细胞1000rpm（约150g）离心3min，弃上清，再用新鲜培养基重悬37度培养箱继续培养；

传代比例: 不同细胞生长速度不一，具体传代比例视细胞生长速度而定，大部分细胞适用1:3-1:4传代，生长较慢的细胞可以1:2传代。

Cell cryopreservation

1.冻存液：92%培养基+8%DMSO（可以根据实验室条件自行选择）

2.降温步骤：4度10min，-20度2h，-80过夜后液氮保存。

Tips：

1.细胞经过运输后，部分细胞由于温度变化及剧烈碰撞死亡破碎形成碎片，是正常现象。贴壁细胞可以消化，悬浮细胞直接混匀收集细胞，900-1000rpm(约150g)离心3min，弃上清。加5ml PBS重悬细胞，再900-1000rpm(约150g)离心3min，用新鲜的培养基重悬接种到新的培养瓶。第二次PBS重悬是为了去除碎片，如果平时碎片比较少，传代时可以省略PBS重悬的步骤；如果碎片很多，建议PBS多洗几次。

2.细胞生长不均时，可以将细胞消化吹散后加入新的培养基重新接种或传代。

3.细胞生长缓慢时，可以选择提高血清浓度培养（z高不超过20%），也可以根据细胞生长状态，选择传代细胞到新的培养瓶中继续培养。

4.不同细胞贴壁性差异比较大，所以消化时间差别较大，20s-10min均有可能，具体以细胞消化到相互分离但未脱落，并可以轻轻吹下为准，严禁消化到细胞漂浮。客户消化过度导致细胞死亡、漂浮、生长缓慢，不提供免费售后服务。

5.干冰发货均为两支，客户先复苏一支，若复苏失败及时联系我方并在我方指导下复苏第二支。若客户同时复苏两支均状态不佳，我方不提供免费售后服务。

6.细胞状态正常时，应尽快冻存细胞保种，冻存后应随机抽取一支检测冻存效果。我方不对客户冻存细胞导致死亡负责，客户冻存细胞死亡不提供免费售后服务。