组织样本蛋白提取后如何进行定量？

组织蛋白提取后蛋白定量（面向质谱蛋白质组）

组织裂解得到蛋白上清之后，优先选BCA，不推荐 Bradford、A280，要结合样本基质、裂解液成分选择，同时做好空白、标准品与质控，定量不准会直接导致上样量偏差，造成组学定量结果失真。

常用方法对比与适用场景

BCA 法是质谱组织样本的。它受尿素、弱盐影响小，对 SDS 有一定耐受，适合 SDS 裂解液、8M 尿素裂解液的组织蛋白裂解液。但是高浓度 DTT、EDTA、强还原剂会干扰显色，样本里如果 DTT 浓度高，需要稀释降低干扰。操作在微孔板中完成，线性范围一般 20‑2000 μg/mL，适合组织提取的蛋白浓度区间。

Bradford 考马斯亮蓝，对 SDS 极度敏感，如果裂解液含有 SDS，会直接造成读数偏高、颜色异常，不适合 SDS 裂解的组织样本；只适合无去污剂的蛋白溶液，组织蛋白组很少作为主定量手段。

A280 紫外吸收法，操作快不消耗样本，但受核酸、多肽、色素、组织脂质杂质干扰很大。组织裂解液经常混有核酸、血红素，A280 读数虚高，不能作为组织蛋白组的准确定量依据，仅可以做粗略预估。

BCA 完整操作要点（组织裂解上清）

设置空白对照：用和样本完全一致的裂解液做空白，不是用水。裂解液里面的 SDS、尿素、抑制剂都会有本底，如果用水做空白，定量结果整体偏高。

配制 BSA 标准品，用同样裂解液稀释标准曲线点，保证基质匹配，消除裂解基质带来的系统偏差。

组织蛋白上清根据预估浓度做适度稀释，使稀释后浓度落在标准曲线中间区间。组织裂解液蛋白浓度经常很高，不稀释会直接超线性，读数失效。

按照试剂盒说明加试剂，孵育温度、时间严格统一；微孔板注意不要产生气泡，气泡会造成孔读数异常。

酶标仪测 562 nm 吸光值，扣除裂解液空白，拟合标准曲线计算样本蛋白浓度，再换算回原始未稀释样本的实际浓度。

注意：如果裂解液中 DTT＞5 mM，会明显抑制 BCA 显色。若是含高 DTT 的样本，要么加大稀释倍数，要么在定量前小份样本去除还原剂，或者改用兼容还原剂的改良 BCA 试剂盒。

组织样本特有的问题

组织裂解上清经常混有少量脂质、核酸碎片。离心后吸取上清尽量避开上层脂质层，不要吸到管底沉淀。脂质会干扰 BCA 显色，造成读数漂移。

冻存组织提取的样本，偶尔会有少量血红素（血液残留），血红素会干扰 BCA，同一个样本建议做 2 个技术复孔，复孔差值过大提示基质干扰严重。

定量之后的质控校验（质谱前很关键）

BCA 得到浓度只是数值，搭配 SDS‑PAGE 做校验。取等量蛋白上样电泳。合格样本：泳道条带分布均匀，没有大片弥散降解；如果同样 BCA 计算的上样量，部分泳道条带明显弱，提示 BCA 受基质干扰，定量不准。

如果样本存在血浆蛋白污染，BCA 只能测总蛋白，不能区分是组织蛋白还是血浆来源蛋白，这个只能靠 WB 或质谱后端判断，定量本身识别不出污染。

定量后如何用于质谱前处理

拿到原始蛋白浓度（μg/μL），就可以计算体积，取出目标总蛋白量，例如每个组学样本取 50‑100 μg 总蛋白，进行后续 DTT 还原、IAA 烷基化、酶解。

记录好蛋白得率：总蛋白 ÷ 原始组织重量（mg），可以用来评估裂解提取效率。不同组织得率会有差异，如果同批次同类型组织得率差异巨大，要回顾破碎、裂解、PBS 漂洗是否存在问题。

常见错误

用水代替裂解液做空白，定量整体虚高；样本浓度过高不稀释，超出标准曲线；SDS 裂解液用 Bradford 定量；吸取上清带入沉淀或油脂，读数波动大；只测单孔，没有技术复孔。

论文方法学写法参考

采用 BCA 蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度，以对应裂解液作为空白，BSA 制备标准曲线；等量蛋白进行 SDS‑PAGE 电泳评估蛋白完整性，取定量合格蛋白用于后续还原烷基化及胰蛋白酶解。