组织样本用 PBS 清洗后，如何进行蛋白提取？

PBS 清洗吸干后组织样本蛋白提取（质谱蛋白质组学适用）

组织经预冷 PBS 快速漂洗、滤纸充分吸干表面液体之后，全程保持低温，避免蛋白降解与修饰丢失；分为冻存样本提取、新鲜即刻提取两种情况，裂解液优先选择质谱兼容体系，避免难去除的强去污剂。

如果是已经液氮速冻、‑80℃保存的组织，不要完全融化至室温。取出冻存管，冰上放置，组织处于半冻坚硬状态时称重，剪取需要的重量，一般取 20‑100 mg 组织。不要化冻，一旦完全融化，内源蛋白酶即刻激活，磷酸化等修饰位点会快速丢失。新鲜取材未冻存的组织，吸干后直接冰上称重处理。

组织破碎

破碎是组织蛋白提取的关键，不同质地组织选择不同破碎方式。

软组织，如肝脏、肾脏、脑：使用高通量组织研磨仪，组织放入研磨管，加入陶瓷研磨珠，再加入裂解液。

偏硬、纤维丰富组织，如心脏、骨骼肌、纤维化肿瘤：研磨仪破碎往往不充分，优先采用液氮研钵研磨，把组织在液氮环境下研磨成细腻白色粉末，粉末不要融化，快速转移到预冷裂解液中。研钵、杵提前液氮预冷，防止粉末融化粘连。

注意不要室温研磨，产热会造成蛋白变性降解。

裂解液配制（质谱蛋白组常用两种）

种，SDS 裂解液，适合绝大多数组织，蛋白抽提效率高，尤其难溶膜蛋白。配方示例：4% SDS，100 mM Tris‑HCl pH7.6。普通总蛋白组加入蛋白酶抑制剂；做磷酸化、泛素化、乙酰化修饰组，必须同时添加蛋白酶抑制剂 + 磷酸酶抑制剂。后续酶解需要通过 FASP 或者 SDS 去除步骤，消除 SDS 对胰酶的抑制。

第二种，尿素裂解液：8 M 尿素，100 mM Tris‑HCl pH8.0。质谱兼容性好，不需要后续除 SDS 步骤；缺点对膜蛋白溶解能力弱，尿素温度不能超过 37℃，防止蛋白氨基甲酰化修饰。修饰组同样补全抑制剂。

组织和裂解液比例，常规按照 1 mg 组织加入 5‑10 μL 裂解液，含水量高的组织可适当降低比例，纤维化硬组织可以适当提高裂解液用量。务必保证组织表面 PBS 已经吸干，残留 PBS 会稀释裂解液，改变 SDS、尿素浓度，降低裂解效率，引入过多盐分。

裂解、超声助溶、离心取上清

组织与裂解液混合后，冰上进行超声破碎，采用短脉冲模式，低功率，间歇冷却，全程冰浴。严禁超声产热，温度升高会造成蛋白交联、降解。

超声结束，冰上孵育 15‑30 min 充分裂解。之后 4℃，高速离心，12000‑14000 g，离心 20‑30 min。小心吸取上清，不要吸到底部组织沉淀、脂质层。沉淀丢弃，上清就是组织总蛋白溶液。如果样本脂质含量高，比如脂肪组织，离心后上层会有浮油，取样避开油脂。

蛋白定量与质控

取少量上清用 BCA 法测定蛋白浓度，不建议用 Bradford，SDS 会干扰 Bradford 显色。记录蛋白得率，可以反向评估样本是否出现蛋白渗漏、裂解是否充分。

可选质控：SDS‑PAGE 跑胶，观察条带完整性，判断是否发生明显降解；如果担心血浆污染，可做白蛋白 WB 验证。

裂解后衔接质谱前处理

得到蛋白上清之后，分两种处理路径。

使用含 SDS 裂解液的样本：采用 FASP 过滤，或者丙酮沉淀去除 SDS，之后进行 DTT 还原、IAA 烷基化，再加入胰蛋白酶酶解。

使用 8M 尿素裂解液样本：用缓冲液把尿素稀释到 2M 以下，再进行还原烷基化、直接加胰蛋白酶溶液酶解。

关键实操风险点

全程低温，从破碎到离心取上清尽量冰上操作，减少蛋白酶激活。修饰组对温度更加敏感，操作时间尽量压缩。

超声是助裂解手段，不是时间越长越好，过热是样本报废最常见的原因。

冻存组织严禁完全融化后再破碎，半冻状态操作，保护蛋白与翻译后修饰。

PBS 残留是很容易忽视的问题，漂洗后一定要吸干；带入裂解体系会稀释试剂，盐离子升高，干扰后续酶解、色谱与质谱。

不要留存沉淀反复裂解，沉淀多代表破碎不足，需要优化破碎方式，而不是反复重溶。

丙酮沉淀、FASP 处理时，注意蛋白吸附损失，低蛋白得率样本要减少转移步骤。

论文方法学参考

组织经预冷无钙镁 PBS 快速漂洗，滤纸吸干表面液体，液氮速冻后‑80℃保存。蛋白提取时，样本冰上半冻状态称重，液氮研磨为粉末，加入含蛋白酶（及磷酸酶）抑制剂的 4% SDS 裂解液，冰上超声裂解；4℃高速离心取上清，BCA 测定蛋白浓度，后续采用 FASP 法去除 SDS，进行还原烷基化与胰蛋白酶解。