与年龄相关的血脑屏障（BBB）功能障碍和脑血管及神经退行性疾病有关，但其潜在机制尚不清楚。近期，中国科学院深圳技术研究院畅君雷教授团队在Neuron(IF 16.9)上发表文章“TGF-β1-induced endothelial transcytosis drives blood-brain barrier leakage during aging”，研究确定了TGF-β1诱导的内皮转胞吞作用是年龄相关BBB功能障碍的核心机制，并为年龄相关神经血管疾病的脑健康保护提供了潜在的治疗靶点。

· 维真助力 - 慢病毒和AAV·

体内实验

基因信息：Cav-1，编码胞质凹陷结构蛋白；Mfsd2a，编码脂质转运蛋白

实验动物：16-18月龄C57BL/6J小鼠、4周龄C57BL/6J小鼠

病毒产品：AAV9-CAG-miR30-shScr、AAV9-CAG-miR30shCav-1；

AAV-BI30-CAG-EGFP、AAV-BI30-CAG-Mfsd2a；

注射方式：尾静脉注射

病毒用量：1×10^11 vg/25g体重

体外实验

实验细胞：hCMEC/D3

病毒产品：LV-CMV-Mfsd2a、LV-CMV-EGFP-Mfsd2a；LV-CMV-EGFP、LV-CMV

MOI：10

感染时间：48h

免疫荧光实验证明Cav-1成功敲低、Mfsd2a成功过表达

结果展示

1. Caveolar胞吞作用介导了衰老早期血脑屏障的渗漏

作者发现在衰老的早期阶段会发生BBB渗漏，并且这种渗漏主要由内皮细胞跨细胞转运的激活所驱动。接下来作者测试了Cav-1是否是年龄相关血脑屏障渗漏所必需的，使用AAV9-CAG-miR30shCav-1在老龄小鼠中敲低内皮细胞Cav-1，发现Cav-1敲低显著减少了老龄小鼠内皮细胞中的囊泡数量，减轻了老龄小鼠的血脑屏障渗漏。为确定恢复内皮细胞Mfsd2a表达能否抵消与年龄相关的BBB功能障碍，作者使用AAV-BI30-Mfsd2a在老龄小鼠中过表达Mfsd2a，发现Mfsd2a过表达老年小鼠表现出显著降低的囊泡转胞吞作用和BBB渗漏。这些结果表明，随着年龄增长，BBB渗漏的主要驱动因素是胞吞转运增加，这一过程由Mfsd2a减少和Cav-1表达增加引发，导致血管内皮中过量的囊泡转运。

图1 Caveolar胞吞作用介导了衰老早期血脑屏障的渗漏

2. TGF-β1通过TGFBR1/2-Smad2/4通路抑制脑内皮细胞中Mfsd2a的转录

作者在脑内皮细胞中筛选了Mfsd2a下调的分子触发因子，发现TGF-β1以剂量和时间依赖的方式抑制了hCMEC/D3中MFSD2A蛋白表达，机制研究表明TGF-β1通过TGFBR1/2-Smad2/4信号通路直接调控Mfsd2a的转录，并通过抑制脑内皮细胞中Mfsd2a的表达来增加体外脑内皮细胞中囊泡的形成和货物摄取。体内实验发现，在年轻小鼠脑内上调TGF-β1，能通过减少Mfsd2a促进内皮转胞吞作用和血脑屏障泄漏。通过静脉注射腺病毒载体Ad-TGF-β1提高年轻小鼠血液中的TGF-β1水平，同样可以减少脑内皮细胞Mfsd2a的表达，进而导致血脑屏障泄漏。

图2 TGF-β1抑制脑内皮细胞中Mfsd2a的表达并增加胞吞作用

3. 内皮细胞特异性Tgfbr2敲除减轻老年小鼠胞吞作用和血脑屏障泄漏

为验证内皮细胞TGF-β-Smad2信号通路是否驱动衰老过程中的血脑屏障破坏，作者构建了诱导型内皮细胞特异性Tgfbr2敲除（ECKO）小鼠，发现衰老Tgfbr2 ECKO小鼠脑内皮细胞中pSmad2水平与年轻WT小鼠相当，表明内皮细胞Tgfbr2的缺失降低了衰老小鼠中观察到的Smad2过度激活现象，此外衰老小鼠的内皮细胞Tgfbr2敲除保留了更高的Mfsd2a表达水平。HRP-TEM和DAB染色表明，老年野生型小鼠海马区表现出增加的HRP填充囊泡和HRP血管外渗现象，而老年ECKO小鼠则表现出该现象的减弱。IF染色和Western印迹证实了老年野生型小鼠脑组织存在广泛的血管外IgG沉积，而老年Tgfbr2 ECKO小鼠则显著改善了这一现象。这些发现表明内皮细胞中的TGF-β信号传导促进了与年龄相关的Mfsd2a下调，进而增强了内皮转胞吞作用和血脑屏障的泄漏。进一步研究发现药理学抑制TGF-β信号传导可减轻老年小鼠的血脑屏障泄漏并改善其神经功能。

图3 内皮细胞特异性Tgfbr2敲除减轻老年小鼠胞吞作用和血脑屏障泄漏

实验结论

本研究阐明了与年龄相关的血脑屏障渗漏的机制，并强调了过量TGF-β1诱导的内皮细胞跨细胞转运作为治疗与年龄相关的神经血管功能障碍的潜在靶点，对脑小血管病和血管性认知障碍具有直接的临床意义。