分化路径与功能（Innate Lymphoid Cells, ILCs）是一类重要的先天免疫细胞，虽无T细胞受体，但在表型和功能上与T细胞相似。它们依据特异性转录因子和分泌的细胞因子分为ILC1、ILC2、ILC3等亚群，在淋巴组织发育、组织修复及抗感染免疫中发挥关键作用。ILCs能快速响应局部微环境信号，调节炎症与免疫稳态。其亚群比例或功能失调与过敏性疾病、慢性感染、代谢紊乱及肿瘤等多种疾病密切相关，被视为连接先天与适应性免疫的重要枢纽，具有潜在的治疗价值。

ILC细胞分类

天然淋巴细胞（ILCs）主要包括ILC祖细胞（ILCP）、成熟自然杀伤（NK）细胞、ILC1、ILC2、NCR⁺ ILC3、NCR⁻ ILC3，以及CCR6⁺的淋巴组织诱导（LTi）样ILC3和调节性ILC（ILCreg）等亚群。这些亚群依据表面标志物、转录因子及功能特征进行区分，在免疫防御、组织稳态、炎症调控和淋巴器官形成中各司其职。不同ILC亚群的平衡对维持免疫稳态至关重要，其失调与多种炎症、感染及肿瘤性疾病密切相关。

分化路径与功能

该图揭示了ILC1的发育路径及其在免疫应答中的关键作用。ILC1可由PLZF⁺Id2⁺前体在IL-15刺激下经T-bet驱动直接分化，也可由ILC3在IL-12和IL-15作用下转分化为Ex-ILC3（表达T-bet和低水平RORγt）。二者均分泌IFN-γ，参与清除艰难梭菌、弓形虫和乙肝病毒等病原体，同时在炎症性肠病（IBD）中发挥双重作用——既介导保护性免疫，又可能加剧肠道炎症。该图凸显了ILC1的可塑性及其在感染与自身免疫调控中的核心地位。

为什么ILC这么难分析

ILC家族主要包括ILC1、ILC2和ILC3三个亚群，均为谱系阴性（Lin⁻），不表达RAG依赖的抗原受体，也无法通过TCR或BCR识别。常规小鼠Lin cocktail包含Ter119、Gr-1、CD11c、CD11b、CD19及T细胞标志物（如CD3ε/TCR）等，用于排除成熟造血细胞。然而，Lin⁺与Lin⁻界限常不清晰，部分细胞低水平表达Lin标志物；更关键的是，若将T细胞标记纳入Lin cocktail，在设门时难以完全排除TCR⁺ T细胞污染，导致ILC群体中混入T细胞，这是造成不同研究间结果不一致的主要原因。如图所示，即使在Lin⁻门内仍可见明显TCR⁺细胞残留。

T细胞标志物必须单独染色

为减少T细胞污染，研究者改进了ILC鉴定策略：将CD3ε/TCR抗体从Lin cocktail中移除，改用独立荧光通道单独标记，从而在设门时排除TCR⁺细胞，显著提升ILC分析的准确性。实验采用C57BL/6J、Rorγt-eGFP报告及Rag1⁻/⁻小鼠，分析肝脏、肺、脾脏和小肠组织。各组织经特异性处理：肝脏通过Percoll梯度离心富集免疫细胞；肺组织经胶原酶IV和DNase I消化后Percoll纯化；小肠则先去除上皮细胞，再经胶原酶VIII和DNase I消化，并逐级过滤获得单细胞悬液。

ILC1、ILC2、ILC3鉴定

ILC亚群的准确鉴定需结合组织特异性标志与转录因子。在B6小鼠肝脏中，ILC1定义为Lin⁻ NKp46⁺ NK1.1⁺ TCR⁻ CD49a⁺ CD49b⁻（Eomes⁻T-bet⁺RORγt⁻），需警惕CD49a在T/NKT细胞中的交叉表达，并避免依赖Thy1或CD127。ILC2表型因组织而异：肺ILC2多为ST2⁺，而小肠ILC2多为ST2⁻但高表达KLRG1和IL-17RB；肝脏ILC2则呈ST2⁺/⁻混合。ILC3因表面标志重叠度高，必须依赖RORγt（或Rorγt-eGFP报告）确认，典型表型为Lin⁻ Thy1⁺ CD127⁺ TCR⁻ RORγt⁺，部分表达NKp46，但NK1.1阴性可与ILC1/NK区分。值得注意的是，野生型小鼠肺中ILC3极少，而在Rag1⁻/⁻小鼠中显著扩增。综合使用多色流式与转录因子染色是解析ILC亚群的关键。

建议

鉴定ILC需严格排除T细胞污染——建议将CD3ε/TCR与Lin cocktail分通道染色；不同组织中ILC标志物表达差异显著，应采用组织特异性策略；转录因子（GATA3、RORγt、T-bet/Eomes）是亚群确认的关键；CD49a、Thy1、CD127、ST2等标志均非绝对特异，须组合判读。在通道有限时，可考虑光谱流式提升多参数能力。可靠的流式分析是ILC研究的基石。菲恩生物提供专业流式配色设计与高品质抗体，优化多色组合，提升检测灵敏度与准确性，助力免疫学、肿瘤及自身免疫疾病研究，诚邀科研与临床合作！

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